Génération de tissu myocardique alignés fonctionnelle grâce à l'impression par microcontact
Summary
La génération de tissu myocardique alignés est une exigence essentielle pour adapter les progrès récents de la biologie des cellules souches à des fins utiles en clinique. Ici nous décrivons une approche impression par microcontact pour le contrôle précis de la forme et la fonction cellulaire. Utilisation populations hautement purifiées de cellules souches embryonnaires dérivées progéniteurs cardiaques, nous avons ensuite générer anisotrope tissu fonctionnel du myocarde.
Abstract
Insuffisance cardiaque avancée représente un important défi clinique insatisfait, résultant de la perte d'viables et / ou entièrement fonctionnel des cellules musculaires cardiaques. Malgré un traitement médicamenteux optimal, l'insuffisance cardiaque représente une cause majeure de mortalité et de morbidité dans le monde développé. Un défi majeur dans le développement de médicaments est l'identification des dosages cellulaires qui précise récapitulent normal et pathologique du myocarde physiologie humaine in vitro. De même, les défis majeurs de la biologie régénérative cardiaque tournent autour de l'identification et l'isolement des patients spécifiques progéniteurs cardiaques en quantités cliniquement pertinentes. Ces cellules doivent ensuite être assemblés en tissu fonctionnel qui ressemble à l'architecture du tissu cardiaque native impression par microcontact. Permet la création de formes précises de protéines qui ressemblent à micro-organisation structurelle du cœur, fournissant ainsi des indices géométriques pour contrôler l'adhésion cellulaire dans l'espace. Présentesnous décrivons notre approche pour l'isolement de cellules myocardiques hautement purifiée à partir de cellules souches pluripotentes de différenciation in vitro, la génération de surfaces de croissance des cellules à micro avec protéines de matrice extracellulaire, et l'ensemble des dérivés de cellules souches cellules du muscle cardiaque dans le tissu myocardique anisotrope.
Introduction
Malgré les progrès récents dans le traitement médical, l'insuffisance cardiaque avancée reste une cause majeure de mortalité et de morbidité dans le monde développé. Le syndrome clinique résulte d'une perte de tissu myocardique fonctionnelle et par la suite une incapacité du cœur à défaut de répondre aux besoins métaboliques des personnes concernées. Puisque le cœur a une capacité limitée de régénération, la transplantation cardiaque autologue est le seul traitement actuel cliniquement acceptée directement destinées à reconstituer le tissu cardiaque perdu fonctionnelle. Inconvénients majeurs de la transplantation cardiaque, y compris un nombre limité de coeur de donneur et de la nécessité à long terme un traitement immunosuppresseur, obstacle à l'utilisation très répandue de cette thérapie. En conséquence, le traitement médical a été la pierre angulaire du traitement pour les patients souffrant de maladies cardiaques. Un défi majeur dans le développement de médicaments est l'identification des dosages cellulaires qui récapitulent fidèlement la physiologie normale et pathologique du myocarde in vitro.
La récente convergence de la biologie des cellules souches et génie tissulaire technologie soulève de nouvelles avenues prometteuses pour la régénération cardiaque. Fonctionnelle génératrice tissu myocardique d'une ressource renouvelable spécifique au patient source serait une avancée majeure dans le domaine. Cela permettrait le développement de maladies spécifiques essais cellulaires pour le développement de médicaments et de découverte et jetterait les bases pour la médecine régénérative cardiaque. Homme souches embryonnaires (ES) et des cellules, de manière plus significative, l'homme souches pluripotentes induites (iPS) représentent un potentiel renouvelable spécifique au patient source de cellules souches ventriculaires et les myocytes ventriculaires adultes. La combinaison de la biologie des cellules souches et stratégies de génie tissulaire répond à ce problème en générant le tissu cardiaque fonctionnel di vitro qui peut être utilisé dans le développement de tests cellulaires pour la découverte de médicaments cardiaques ou des approches régénératives pour le traitement de l'insuffisance cardiaque avancée.
_content "> Un défi majeur dans la régénération cardiaque a été l'identification d'un type cellulaire optimale. Un large éventail de cellules ont été étudiés 1, mais à ce jour, bien que différents précurseurs multipotentes cardiogéniques provenant de diverses sources ont été découverts, l'identification d'une cellule source qui répond aux besoins essentiels tels que l'engagement au sort cellule myogénique, le maintien de la capacité de se développer in vivo ou di vitro et la composition d'un tissu fonctionnel du myocarde s'est avéré être un problème central 2. Nous avons déjà décrit un système de double transgénique murin qui permet l'isolement de populations hautement purifiée de progéniteurs engagés ventriculaire (PVC) à partir de cellules souches embryonnaires de différentiation in vitro. Nous avons produit une nouvelle souris double transgénique qui exprime la protéine fluorescente rouge DsRed sous le contrôle d'un amplificateur Isl1 dépendant du gène MEF2C et la protéine fluorescente verte améliorée sous le contrôle d'le cardio-spécifique Nkx2.5 amplificateur. Sur la base de ce système bicolore rapporteur fluorescent, premier et deuxième progéniteurs cardiaques sur le terrain du développement des cellules ES peuvent être isolés au moyen de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) en fonction de leur expression de gènes MEF2C et Nkx2.5. CVP ressemblent myocytes cardiaques en fonction des profils d'expression de marqueurs myocardiques et les qualités structurelles et fonctionnelles 3, ce qui offre de grandes promesses pour des fins de régénération des tissus cardiaques.Bien qu'il y ait eu de nombreuses avancées dans le domaine de l'ingénierie tissulaire, imitant natif architecture cellulaire reste un défi majeur. Les méthodes conventionnelles pour relever ce défi incluent ensemencement échafaudages biologiques ou synthétiques avec des cellules in vitro. En raison d'un certain nombre d'inconvénients d'échafaudages, y compris la dégradation rapide, limitée stabilité physique et mécanique et faible densité cellulaire 1,4,5, nous avons tenté de concevoir un échafaudage moins de tissu. Altien que les cellules cardiaques peuvent modifier leur micro-environnement local par la sécrétion de protéines de la matrice extracellulaire, ils ont une capacité plus limitée à s'organiser pour tige en forme de myocytes cardiaques en l'absence de signaux extracellulaires. Ainsi, un modèle qui fournit les cellules appropriées repères spatiaux et biologiques pour composer fonctionnelle tissu myocardique est nécessaire. L'impression par microcontact répond à ce défi en proposant une technique simple et peu coûteux pour contrôler avec précision la forme des cellules, l'organisation et la fonction 6-8, qui sont tous essentiels pour la production d'aligner le tissu myocardique fonctionnelle. Il comprend l'utilisation de microtexturée polydiméthylsiloxane (PDMS) avec des tailles de fonction Stamps allant jusqu'à 2 microns 9 qui permettent le dépôt de protéines de la matrice extracellulaire sur des substrats PDMS selon des schémas précis et donc d'affecter l'adhésion cellulaire spatialement.
Ici, nous proposons de combiner la technologie bio-ingénierie tissulaire avec tige cell la biologie de générer anisotrope tissu fonctionnel du myocarde. En conséquence, nous avons ici de démontrer notre approche récemment publiée dans les cas suivants: (1) la génération de surfaces de PDMS à micro-protéines substrats par impression par microcontact pour la génération d'un modèle aligné tissu myocardique, (2) l'isolement des progéniteurs cardiaques hautement purifiée à partir de différenciation des cellules ES in vitro, et (3) la combinaison de ces deux techniques pour générer aligné fonctionnelle du tissu myocardique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous avons présenté une méthode pour isoler les populations purifiées de progéniteurs cardiogénique et les graines sur des substrats de fibronectine à micro ce qui leur permet d'aligner et de prendre une forme de tige myocytes cardiaques comparables. Organisation cellulaire normale est essentielle pour la fonction de tissus normaux 8,10, en particulier pour le tissu myocardique. Les myocytes cardiaques ont été montré pour élaborer de meilleures propriétés mécaniques et <su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été effectué en partie au Centre pour les systèmes nanométriques (SNC), un membre de la National Nanotechnology Infrastructure Network (NNIN), qui est soutenu par la National Science Foundation sous NSF prix pas. ECS-0335765. SNC fait partie de l'Université de Harvard.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
Riferimenti
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D., Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
