Microcontact मुद्रण के माध्यम से निरपेक्ष कार्यात्मक दौरे के ऊतकों का सृजन
Summary
गठबंधन दौरे के ऊतकों की पीढ़ी चिकित्सकीय उपयोगी प्रयोजनों के लिए स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों के अनुकूल ढालने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है. के साथ साथ हम सेल आकार और समारोह के सटीक नियंत्रण के लिए एक microcontact मुद्रण दृष्टिकोण का वर्णन करता है. हृदय progenitors व्युत्पन्न भ्रूण स्टेम सेल के उच्च शुद्ध आबादी का उपयोग करना है, हम तो anisotropic कार्यात्मक दौरे ऊतक उत्पन्न करते हैं.
Abstract
उन्नत दिल की विफलता एक प्रमुख unmet नैदानिक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है, व्यवहार्य और / या पूरी तरह कार्यात्मक हृदय की मांसपेशी कोशिकाओं के नुकसान से उत्पन्न होने वाली है. इष्टतम दवा चिकित्सा के बावजूद, दिल की विफलता और विकसित दुनिया में मृत्यु दर और रुग्णता का एक प्रमुख कारण का प्रतिनिधित्व करता है. नशीली दवाओं के विकास में एक प्रमुख चुनौती सेलुलर assays की पहचान सही है कि सामान्य और रोगग्रस्त इन विट्रो में मानव दौरे शरीर क्रिया विज्ञान पुनरावृत्ति करना है. इसी तरह, पुनर्योजी हृदय जीव विज्ञान में प्रमुख चुनौतियों की पहचान और नैदानिक प्रासंगिक मात्रा में रोगी विशेष के हृदय progenitors के अलगाव के आसपास घूमता है. इन कोशिकाओं को फिर कार्यात्मक ऊतक कि देशी हृदय के ऊतकों वास्तुकला microcontact मुद्रण सटीक micropatterned प्रोटीन आकार है कि दिल के संरचनात्मक संगठन सदृश के निर्माण के लिए अनुमति देता है जैसा दिखता में इकट्ठे हो सकता है, इस तरह ज्यामितीय cues प्रदान करने के लिए सेल आसंजन spatially नियंत्रित है. यहाँहम अत्यधिक pluripotent स्टेम कोशिकाओं से इन विट्रो, सेल विकास कोशिकी मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ micropatterned सतहों की पीढ़ी में फर्क myocardial कोशिकाओं शुद्ध अलगाव के लिए हमारे दृष्टिकोण का वर्णन है, और स्टेम सेल व्युत्पन्न anisotropic दौरे के ऊतकों में हृदय की मांसपेशी कोशिकाओं के विधानसभा.
Introduction
चिकित्सा उपचार में हाल के अग्रिमों के बावजूद, उन्नत दिल की विफलता और विकसित दुनिया में मृत्यु दर और रुग्णता का एक प्रमुख कारण बनी हुई है. नैदानिक सिंड्रोम कार्यात्मक दौरे के ऊतकों का नुकसान और बाद में असफल दिल की अक्षमता प्रभावित व्यक्तियों की चयापचय की मांग को पूरा करने से उठता है. चूंकि दिल एक सीमित पुनर्योजी क्षमता है, ऑटोलॉगस हृदय प्रत्यारोपण केवल वर्तमान चिकित्सकीय स्वीकार किए जाते हैं सीधे खो कार्यात्मक हृदय के ऊतकों भरपाई उद्देश्य चिकित्सा है. हृदय प्रत्यारोपण के दाता दिल की एक सीमित संख्या और की जरूरत है, लंबी अवधि के immunosuppressive चिकित्सा के लिए इस चिकित्सा के व्यापक प्रसार का उपयोग बंद करना सहित महत्वपूर्ण कमियां है,. एक परिणाम के रूप में, चिकित्सा उपचार उपचार का मुख्य आधार हृदय रोग के साथ रोगियों के लिए किया गया है. नशीली दवाओं के विकास में एक प्रमुख चुनौती सेलुलर assays की पहचान सही है कि इन विट्रो में सामान्य और रोगग्रस्त दौरे शरीर क्रिया विज्ञान पुनरावृत्ति करना है.
स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और ऊतक इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकी के हाल ही में अभिसरण हृदय उत्थान के लिए नए होनहार रास्ते उठाती है. रोगी विशेष के एक अक्षय स्रोत से उत्पन्न कार्यात्मक दौरे के ऊतकों के क्षेत्र में एक प्रमुख अग्रिम होगा. यह रोग दवा के विकास और खोज के लिए विशिष्ट सेलुलर assays के विकास के लिए अनुमति देते हैं और हृदय पुनर्योजी चिकित्सा के लिए नींव रखना होगा. मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) और, अधिक महत्वपूर्ण है, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) के एक संभावित अक्षय ventricular पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं और परिपक्व वेंट्रिकुलर myocytes रोगी विशेष के स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं. स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों के संयोजन इन विट्रो में कार्यात्मक हृदय के ऊतकों है कि दवाओं की खोज के लिए या उन्नत दिल की विफलता के उपचार के लिए हृदय पुनर्योजी दृष्टिकोण में सेलुलर assays के विकास में इस्तेमाल किया जा सकता है पैदा करके इस समस्या को संबोधित है.
_content "> हृदय उत्थान में एक केंद्रीय चुनौती एक इष्टतम सेल प्रकार की पहचान किया गया है कोशिकाओं की एक विस्तृत सरणी 1 किया गया अध्ययन किया है, लेकिन तारीख करने के लिए, हालांकि विभिन्न स्रोतों से अलग multipotent हृदयजनित व्यापारियों की खोज की गई है, एक सेल की पहचान. स्रोत है कि myogenic सेल भाग्य की प्रतिबद्धता के रूप में इस तरह के महत्वपूर्ण आवश्यकताओं को पूरा, vivo में या इन विट्रो और संरचना में एक कार्यात्मक दौरे के ऊतकों का विस्तार करने की क्षमता के रखरखाव के लिए एक केंद्रीय 2 समस्या साबित हो गया है, हम पहले एक डबल ट्रांसजेनिक murine प्रणाली का वर्णन किया है. कि हम एक उपन्यास डबल ट्रांसजेनिक माउस कि MEF2c जीन की एक Isl1 निर्भर बढ़ाने की नियंत्रण के तहत लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन dsRed व्यक्त उत्पन्न और अत्यधिक ES इन विट्रो में फर्क कोशिकाओं से प्रतिबद्ध वेंट्रिकुलर progenitors (CVP) की आबादी को शुद्ध करने के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है. के नियंत्रण के तहत बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीनहृदय विशिष्ट Nkx2.5 बढ़ाने. इस दो रंग फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रणाली, ES कोशिकाओं के विकास से पहली और दूसरी दिल क्षेत्र progenitors प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल उनकी अभिव्यक्ति MEF2c और Nkx2.5 जीन के अनुसार क्रमित कर रहा है (FACS) के माध्यम से अलग किया जा सकता है के आधार पर. CVP हृदय myocytes दौरे मार्करों और संरचनात्मक और कार्यात्मक गुण 3, क्या हृदय ऊतक पुनर्योजी प्रयोजनों के लिए महान वादा करता है की अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर समान है.हालांकि वहाँ ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में बहुत प्रगति कर दिया गया है, मूल सेलुलर वास्तुकला की नकल उतार एक प्रमुख चुनौती बनी हुई है. पारंपरिक तरीकों को इस चुनौती का पता कर इन विट्रो में कोशिकाओं के साथ बोने जैविक या सिंथेटिक scaffolds शामिल हैं. तेजी से गिरावट, सीमित शारीरिक और यांत्रिक स्थिरता और कम सेल घनत्व 1,4,5 सहित scaffolds के नुकसान की एक संख्या के कारण, हम पाड़ कम ऊतक इंजीनियर करने का प्रयास किया है. Although हृदय कोशिकाओं कोशिकी मैट्रिक्स प्रोटीन का स्राव को उनके स्थानीय microenvironment संशोधित कर सकते हैं, वे एक और अधिक सीमित खुद कोशिकी cues के अभाव में छड़ी के आकार हृदय myocytes व्यवस्थित करने की क्षमता है. इस प्रकार, एक टेम्पलेट है कि कोशिकाओं उपयुक्त स्थानिक और जैविक कार्यात्मक दौरे के ऊतकों रचना cues प्रदान की आवश्यकता है. Microcontact मुद्रण एक साधारण और कम खर्चीली तकनीक ठीक सेल आकार, संगठन, और 6-8 समारोह, जो सभी के गठबंधन कार्यात्मक दौरे के ऊतकों की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण हैं को नियंत्रित प्रदान करके इस चुनौती पते. यह सुविधा के आकार के साथ microtextured polydimethylsiloxane (PDMS) 2 9 सुक्ष्ममापी है कि सटीक पैटर्न में PDMS substrates पर कोशिकी मैट्रिक्स प्रोटीन के बयान सक्षम है और इस तरह सेल आसंजन spatially प्रभावित करने के लिए नीचे लेकर टिकटों का उपयोग शामिल है.
के साथ साथ, हम स्टेम सेल के साथ ऊतक bioengineering प्रौद्योगिकी गठबंधन का प्रस्तावएल जीव विज्ञान anisotropic कार्यात्मक दौरे ऊतक उत्पन्न करने के लिए. तदनुसार, हम यहाँ हमारे निम्नलिखित के लिए हाल ही में प्रकाशित एक दृष्टिकोण का प्रदर्शन: (1) microcontact मुद्रण, गठबंधन दौरे के ऊतकों के लिए एक टेम्पलेट के उत्पादन के लिए substrates पर PDMS micropatterned प्रोटीन सतहों की पीढ़ी (2) अत्यधिक से हृदय progenitors शुद्ध अलगाव ES कोशिकाओं इन विट्रो में फर्क है, और (3) दोनों तकनीकों के संयोजन उत्पन्न करने के लिए कार्यात्मक दौरे के ऊतकों गठबंधन.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम एक विधि प्रस्तुत हृदयजनित progenitors के शुद्ध आबादी को अलग करने और उन्हें micropatterned Fibronectin substrates पर बीज के लिए क्या उन्हें पंक्ति में है और एक हृदय रॉड myocyte तरह आकार लेने की अनुमति देता है. सामान्य स?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के हिस्से में नेनो पैमाने सिस्टम (सीएनएस) के लिए केंद्र, राष्ट्रीय नैनो इंफ्रास्ट्रक्चर) (NNIN नेटवर्क है, जो NSF कोई पुरस्कार के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है के एक सदस्य पर प्रदर्शन किया था. ईसीएस 0,335,765. CNS हार्वर्ड विश्वविद्यालय का हिस्सा है.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
Riferimenti
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