Генерация неприсоединения функциональной ткани миокарда Через микроконтактной печати
Summary
Поколение унифицированных ткани миокарда является ключевым требованием для адаптации последних достижений в области биологии стволовых клеток в клинической полезных целей. Здесь мы описываем подход микроконтактной печати для точного контроля формы и функционирование клеток. Использование высокоочищенного популяций эмбриональных стволовых клеток, полученных кардиальных предшественников, мы затем генерировать анизотропные функциональной ткани миокарда.
Abstract
Расширенный сердечная недостаточность представляет собой крупный неудовлетворенной клинической проблемой, возникающие в связи с потерей жизнеспособности и / или полностью функциональный клетки сердечной мышцы. Несмотря на оптимальную медикаментозную терапию, сердечная недостаточность представляет собой основной причиной заболеваемости и смертности в развитых странах мира. Одна из основных проблем в разработке лекарственных средств является выявление клеточных анализов, которые точно воспроизводят нормальной и больной человеческой физиологии миокарда в пробирке. Кроме того, серьезные проблемы в регенеративной биологии сердечной вращаются вокруг выявление и изоляция пациента конкретных кардиальных предшественников в клинически значимых количествах. Эти клетки должны быть собраны в функциональные ткани, которая напоминает родной архитектуры ткани сердца. Микроконтактной печати позволяет создавать точные micropatterned белка формы, которые напоминают структурной организации сердца, обеспечивая тем самым геометрическую сигналы для контроля клеточной адгезии пространстве. Здесьмы описываем наш подход для выделения высокоочищенного клеток миокарда из плюрипотентных стволовых клеток дифференциации в пробирке, поколение рост клеток поверхности micropatterned с белками внеклеточного матрикса, и сборка стволовых клеток, полученных клетки сердечной мышцы в анизотропном ткани миокарда.
Introduction
Несмотря на последние достижения в области медикаментозной терапии, тяжелой сердечной недостаточностью остается одной из ведущих причин заболеваемости и смертности в развитых странах мира. Клинический синдром возникает в результате потери функциональной ткани миокарда, а затем неспособности сердечной недостаточности для удовлетворения метаболических потребностей пострадавших лиц. Так как сердце имеет ограниченный регенеративной способностью, аутологичной трансплантации сердца является единственным текущей клинической терапии принимается непосредственно направленные на восполнение потерянных функциональной ткани сердца. Значительные недостатки трансплантации сердца, в том числе ограниченного числа доноров сердца и потребность в долгосрочных иммуносупрессивной терапии, препятствует широкому распространению использования этой терапии. В результате, медикаментозная терапия была основным методом лечения для пациентов с заболеваниями сердца. Одна из основных проблем в разработке лекарственных средств является выявление клеточных анализов, которые точно воспроизводят нормальных и больных инфарктом физиологии в пробирке.
Последнее сближение биологии стволовых клеток и технологии тканевой инженерии ставит новые перспективные направления для регенерации сердца. Создание функциональной ткани миокарда из возобновляемых пациента конкретного источника будет важным шагом вперед в этой области. Это позволит обеспечить развитие болезни специфического клеточного анализа для разработки лекарств и открытие и заложит основу для сердечной регенеративной медицины. Человека эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и, что более важно, человеческого индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток представляют собой потенциально возобновляемых конкретного пациента источник желудочка клеток-предшественников и зрелые миоциты желудочка. Сочетание биологии стволовых клеток и тканевой инженерии стратегии решает эту проблему путем создания функциональной ткани сердца в пробирке, которые могут быть использованы при разработке клеточных анализов для открытия новых лекарств или в восстановительной сердечной подходы для лечения тяжелой сердечной недостаточностью.
_content "> главная задача в регенерации сердца было выявление оптимального типа клеток. широкий спектр клеток были изучены 1, однако до настоящего времени, хотя и отличаются мультипотентных кардиогенный прекурсоров из различных источников было обнаружено, определение ячейки Источник, который отвечает критическим требованиям, таким как приверженность миогенной судьбу клетки, обеспечение возможности для расширения в естественных условиях или в пробирке и составу функциональных тканей миокарда оказалась центральной проблемой 2. Ранее мы уже описали двойных трансгенных мышиных системы , которая позволяет изоляции высокоочищенных популяций совершенные прародителями желудочка (CVP) из ЭС клеток дифференциации в пробирке. Мы создали новый двойной трансгенные мыши, которая выражает красный флуоресцентный белок DsRed под контролем Isl1-зависимых энхансер гена и Mef2c расширение зеленого флуоресцентного белка под контролемсердечных конкретных Nkx2.5 усилитель. Основываясь на этой двухцветной флуоресцентной системы репортер, первое и второе поле сердца предшественников из развивающихся ЭС клетки могут быть выделены с помощью флуоресценции клеток, активированных сортировки (FACS) в соответствии с их выражением Mef2c и Nkx2.5 генов. CVP напоминают кардиомиоцитов на основе паттерны экспрессии маркеров инфаркта и структурные и функциональные качества 3, что открывает большие перспективы для сердечной цели регенеративных тканей.Хотя было много достижений в области тканевой инженерии, имитируя родной сотовой архитектуры остается ключевой задачей. Обычные методы для решения этой проблемы включают посев биологических или синтетических леса с клетками в лабораторных условиях. В связи с рядом недостатков лесов, в том числе быстрой деградации, ограниченные физические и механической стабильностью и низкой плотности клеток 1,4,5, мы попытались спроектировать эшафот менее тканей. Высокий звукХью сердечных клеток может изменить их местных микроокружения на секрецию белков внеклеточного матрикса, они имеют более ограниченные возможности для самоорганизации в целях стержня формы кардиомиоцитов в отсутствие внеклеточных сигналов. Таким образом, шаблон, который предоставляет клеток соответствующих пространственных и биологические сигналы для составления функциональной ткани миокарда не требуется. Микроконтактной печати решает эту проблему, предоставляя простой и недорогой метод для точного контроля формы клеток, организация и функции 6-8, все из которых имеют решающее значение для создания унифицированных функциональных ткани миокарда. Она включает в себя использование microtextured полидиметилсилоксана (PDMS) марки с функцией размеров в пределах до 2 мкм 9, что позволит осаждения белков внеклеточного матрикса на подложки PDMS в точных моделей и таким образом влиять на клеточную адгезию пространстве.
При этом, мы предлагаем объединить технологии биоинженерии тканей с помощью стволовых челл биологии для создания анизотропного функциональной ткани миокарда. Соответственно, мы здесь продемонстрировать нашу недавно опубликованной подход для следующих целей: (1) об образовании поверхностей micropatterned белка на PDMS субстратов микроконтактной печати для создания шаблонов для унифицированных ткани миокарда, (2) выделение высокоочищенных кардиальных предшественников из ЭС клетки дифференциации в пробирке, и (3) комбинация обоих методов для создания соответствие функциональной ткани миокарда.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе, мы представили метод, чтобы изолировать очищенной популяции кардиогенный предшественников и семя их на micropatterned субстратов фибронектин, что позволяет им согласовать и принять сердечных миоцитов, как стержень формы. Нормальный клеточной организации имеет решающее зн?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была выполнена частично в Центре наноразмерных системы (ЦНС), член Национальной сетевой инфраструктуры нанотехнологий (NNIN), который при поддержке Национального научного фонда NSF в награду нет. ECS-0335765. ЦНС является частью Гарвардского университета.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
Riferimenti
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D., Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
