Изоляция, культура и функциональная характеристика взрослой мыши Cardiomyoctyes
Summary
Здесь мы опишем изоляцию взрослых cardiomyoctyes мыши, используя систему перфузии Лангендорфа. Полученные в результате клетки Ca2 +-терпимым, электрически покоя и можно культивировать и трансфицировали адено-или лентивирусов манипулировать экспрессии генов. Их функциональность также могут быть проанализированы с помощью системы MMSYS и методы патч зажим.
Abstract
Использование первичных кардиомиоцитов (CMS) в культуре дала мощный дополнением к мышиных моделях болезни сердца в продвижении нашего понимания болезни сердца. В частности, способность к обучению ионный гомеостаз, функции ионного канала, сотовой возбудимость и возбуждение-сжатия сцепление и их изменения в болезненных состояниях и болезнетворных мутаций привели к значительным проникновения в сердечных заболеваний. Кроме того, отсутствие адекватной иммортализированной клеточной линии имитировать взрослых CMS, а также ограничения новорожденных КМ (который лишены многих структурной и функциональной биомеханики характеристикой взрослого КМ) в культуре препятствовали наше понимание сложного взаимодействия между сигнальными путями, ионные каналы и сократительные свойства во взрослом сердце укрепление важность изучения взрослых изолированных кардиомиоцитов. Здесь мы представляем методы выделения, культивирования, манипуляции экспрессии генов с помощью аденовирусной-ExpreSSED белки и последующее функциональный анализ кардиомиоцитов из взрослой мыши. Использование этих методов будет способствовать развитию механистической понимание путей, которые регулируют клеточную возбудимость, Ca 2 + динамику и сократимость сигнализации и обеспечивают гораздо более физиологически соответствующие характеристики сердечно-сосудистых заболеваний.
Introduction
Мышиные модели сердечно-сосудистых заболеваний послужили эффективных инструментов для выяснения механизмы, фундаментальной болезни 1,2, а также для идентификации потенциальные терапевтические цели 1,3. В частности, использование обеих мышиных моделей приобретенных пороков сердца (например, давления-перегрузки) 4,5 и трансгенные модели мыши продвинулись наше понимание болезни сердца 6-8. Использование методов культивирования клеток для изучения сигнальных каскадов 3,9,10 и изменения в отдельных белков, которые лежат в основе клеточного возбудимость и возбуждение-сжатия муфту в центре 11-13 на уровне одной клетки дополнили в естественных условиях модели мыши. Тем не менее, отсутствие адекватных клеточных линий, которые отражают структуру взрослых CM и функции значительное ограничение. Исследователи стремились преодолеть эту проблему путем изучения отдельных белков, таких как ионные каналы, в гетерологичных экспрессирующих системах <suр> 14, и, хотя эти исследования предоставили нам полезную информацию с точки зрения биофизики ионных каналов или перемещения белков, недостаточного представительства родного микросреды РВ является существенным ограничением. Во-вторых, так как большинство этих чужеродных клеток не имеют зрелые сократительной аппарата, это не удалось изучить сократительную функцию и сложное взаимодействие между клеточная возбудимость и сжатия. По этой причине, исследователи обратились к первичных культурах клеток сердца для многих из их в пробирке функциональных исследований. Наконец, отдельные исследования кардиомиоцитов позволит оценку сократительной функции без вмешивающихся факторов многоклеточного подготовке включая влияние рубец или фиброз и ориентации волокон.
Первичные новорожденных крыс желудочковая кардиомиоциты (NRVMs) сравнительно легко культуры, могут быть инфицированы аденовирусы и лентивирусы манипулировать экспрессии генов 15,й поэтому были успешно 1 используется, но имеют ограничения своих собственных. Хотя они обеспечивают физиологическую микросреду 1 и были рабочей лошадкой области сигнализации, существенные различия между морфологии и внутриклеточной организации NRVMs и взрослых cardiomyoctyes сделать их неадекватной модели для исследования ионных потоков и возбуждение-сжатия связи в взрослом сердце . В частности NRVMs хватает окончательного т-трубчатые подсистему 4. С Са 2 + поток и динамика критически зависят от зрелой т-трубчатых и саркоплазматического ретикулума (СР) структуры 6, Ca 2 + динамики и функциональных исследований сократительной способности сердечной мышцы в NRVMs не являются точным отражением этих критических процессов у взрослых кардиомиоцитов. Кроме того, некоторые компоненты сигнальных путей различаются новорожденных и взрослых мышей 9, тем самым обеспечивая еще одно ограничение для изучения болезненные процессы и их IMPACT на клеточная возбудимость и сократимость в NRVMs. Наконец, распределение сократительной техники приводит к разнонаправленного и неравномерного сокращения клеток, ограничивающего точность измерений сократительной.
Использование изолированных взрослых кардиомиоцитов предоставляет поэтому более точную систему моделирования в пробирке. Внеочередное рост знаний стало возможным благодаря генетической манипуляции мышей подчеркивает значимость получения функциональных изолированных кардиомиоцитов мышей. На самом деле, характеристика взрослых КМ, выделенных из мышиных моделях пролил свет на многих биологических и патологических событий. Изолированные КМ от трансгенных мышиных моделях позволили для изучения прибыли или потери функции белков на сократительных свойств отдельных клеток 2,16, и жизнеспособности в моделях заболеваний, таких как ишемии / реперфузии 17,18, тем самым дополняя информацию, полученную от в VIVO исследованиямышей SE. Использование изолированных взрослых МС из мышиных моделей приобретенных пороков сердца 3,19,20 (например, поперечной сужением аорты, вызванной перегрузкой давлением, который имитирует гипертонией или аортальный стеноз клапана) или осуществления 5,21 (для моделирования физиологической гипертрофии) позволяет на экспертизу взаимодействия сигнальных каскадов, участвующих в этих процессах с сотовой возбудимости и возбуждение-сжатия муфты на уровне одной клетки. Кроме того, способность манипулировать экспрессии генов с помощью генной экспрессии аденовируса приводом во взрослой КМ дает нам возможность анализировать компоненты сложных сигнальных путей.
С электрофизиологических точки зрения, напряжение цельноклеточная и текущие эксперименты зажим на изолированные взрослого КМ были критически в понимании природы ионных потоков в начале исследования и в различных болезненных состояний. Из-за сложной структуры клеточной мембраны и дифференциального защв строительных лесов структур между взрослой КМ и NRVMs или гетерологичными клеточных линий, способность патч взрослые клетки дает гораздо лучшее представление о последствиях определенных мембранных белков, структурных белков и ионных каналов, взаимодействующих партнеров по электрофизиологических компонентов взрослого сердца.
Несмотря на такие выдающиеся преимущества в изучении взрослых мышиных кардиомиоцитов, выделения и культивирования взрослых мышей кардиомиоциты была сложной, призывая необходимость систематического и точного описания методологии выделения жизнеспособных кардиомиоцитов мыши и поддержания их в культуре, чтобы позволить дальнейшее генетические манипуляции с помощью вирусной векторы. Предыдущие исследования использовали либо остро изолированы мышь взрослых см или культивируют крыса взрослых CMS. Последнее легче культуры, чем взрослых мышей КМ, и большинство экспериментов манипулирования экспрессию генов в пробирке использовали крыс взрослых CMS. В нескольких исследованиях успешно изменен и исследованы functiортогональной экспрессии генов в мышь взрослого МС, представляя большое ограничение в объем экспериментов. Таким образом, здесь мы представляем в деталях таких методологий, модифицированные из предыдущих исследований, для изоляции 7,8,22, культуры 3,10,15,23, аденовирусной инфекции 11-13,15 и функционального анализа взрослых мышей желудочковой cardiomyoctyes. Этот протокол изоляция приводит к Ca 2 +-толерантных, возбудимых кардиомиоцитов, что мы успешно культивировали в течение до 72 часов, а трансфицированы аденовирусом. Функциональность этих изолированных клеток можно оценить с помощью системы визуализации MMSYS 14,24 и патч зажим, который также будет обсуждаться.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом докладе, мы описали методов, необходимых для успешного выделения и культуры взрослого КМ от сердца мыши. Наша методика позволяет последующим изучением функции см и возбудимости использованием способов, описанных выше. Критическим параметром для изучения функциональности взро?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S8282 | |
| D-glucose minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma | B0752 | |
| Collagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Collagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma | A2153 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C8106 | |
| Minimum Essential Media | Sigma | 51411C | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | |
| L-glutamine | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I1884 | |
| Cesium Chloride | Sigma | 289329 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma | E3889 | |
| Cesium Hydroxide Solution | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammonium hydroxide solution | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor optical glass binocular visor | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
Riferimenti
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Ballou, L. M., Lin, R. Z. Rapamycin and mTOR kinase inhibitors. J. Chem. Biol. 1, 27-36 (2008).
- Brette, F., Orchard, C. T-Tubule Function in Mammalian Cardiac Myocytes. Circ Res. , (2003).
- Sakata, Y., Hoit, B., Liggett, S., Walsh, R. Decompensation of pressure-overload hypertrophy in G?q-overexpressing mice. Circulation. , (1998).
- Lieu, D. K., et al. Absence of Transverse Tubules Contributes to Non-Uniform Ca 2+Wavefronts in Mouse and Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 18, 1493-1500 (2009).
- Lim, H., De Windt, L., Mante, J., Kimball, T. Reversal of cardiac hypertrophy in transgenic disease models by calcineurin inhibition. J. Mol. Cell Cardiol. 32 (4), 697-709 (2000).
- Muthuchamy, M., et al. Mouse model of a familial hypertrophic cardiomyopathy mutation in alpha-tropomyosin manifests cardiac dysfunction. Circ. Res. 85, 47-56 (1999).
- Müller, J. G., et al. Differential regulation of the cardiac sodium calcium exchanger promoter in adult and neonatal cardiomyocytes by Nkx2.5 and serum response factor. J. Mol. Cell. Cardiol. 34, 807-821 (2002).
- Epstein, F., Hunter, J. Signaling pathways for cardiac hypertrophy and failure. New England Journal of Medicine. 341 (17), 1276-1283 (1999).
- Snopko, R., Aromolaran, A., Karko, K. Cell culture modifies Ca 2+ signaling during excitation-contraction coupling in neonate cardiac myocytes. Cell Calcium. , (2007).
- Ranu, H., Terracciano, C., Davia, K. Effects of Na+/Ca2+-exchanger overexpression on excitation-contraction coupling in adult rabbit ventricular myocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 34 (4), 389-400 (2002).
- Kaab, S., Nuss, H. B., Chiamvimonvat, N., O’Rourke, B., Pak, P. H., Kass, D. A., Marban, E., Tomaselli, G. F. Ionic mechanism of action potential prolongation in ventricular myocytes from dogs with pacing-induced heart failure. Circ. Res. 78 (2), (1996).
- Splawski, I., et al. Variant of SCN5A sodium channel implicated in risk of cardiac arrhythmia. Science. 297, 1333-1336 (2002).
- Zhou, Y., Wang, S., Zhu, W. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 279 (1), 429-436 (2000).
- Sussman, M., Lim, H., Gude, N., Taigen, T. Prevention of cardiac hypertrophy in mice by calcineurin inhibition. Science. , (1998).
- Heinzel, F. R., et al. Impairment of diazoxide-induced formation of reactive oxygen species and loss of cardioprotection in connexin 43 deficient mice. Circ. Res. 97, 583-586 (2005).
- Li, X., Heinzel, F. R., Boengler, K., Schulz, R., Heusch, G. Role of connexin 43 in ischemic preconditioning does not involve intercellular communication through gap junctions. J. Mol. Cell. Cardiol. 36, 161-163 (2004).
- Rockman, H. A., Ross, R. S., Harris, A. N., Knowlton, K. U., Steinhelper, M. E., Field, L. J., Ross, J., Chein, K. R. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 8277-8281 (1991).
- Nakamura, A., Rokosh, D. LV systolic performance improves with development of hypertrophy after transverse aortic constriction in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281 (3), 1104-1112 (2001).
- Boström, P., et al. A PGC1-?-dependent myokine that drives brown-fat-like development of white fat and thermogenesis. Nature. 481, 463-468 (2012).
- Liao, R., Jain, M. Isolation, culture, and functional analysis of adult mouse cardiomyocytes. Methods Mol. Med. 139, 251-262 (2007).
- Volz, A., Piper, H. M., Siegmund, B., Schwartz, P. Longevity of adult ventricular rat heart muscle cells in serum-free primary culture. J. Mol. Cell. Cardiol. 23, 161-173 (1991).
- Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. -. S. . Methods in Molecular Biology. 689, 205-214 (2010).
- Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269 (2011).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (20), e936 (2008).
- Arman, A. C., Sampath, A. P. Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation. J. Vis. Exp. (43), e2107 (2010).
- Wen, H., Brehm, P. Paired patch clamp recordings from motor-neuron and target skeletal muscle in zebrafish. J. Vis. Exp. (45), e2351 (2010).
- Maier, S., Westenbroek, R. An unexpected role for brain-type sodium channels in coupling of cell surface depolarization to contraction in the heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (6), 4073-4078 (2002).
- Shroff, S. G., Saner, D. R., Lal, R. Dynamic micromechanical properties of cultured rat atrial myocytes measured by atomic force microscopy. Am. J. Physiol. 269, 286-292 (1995).
- Domke, J., Parak, W. J., George, M., Gaub, H. E., Radmacher, M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope. European Biophysics Journal. 28, 179-186 (1999).
- Smith, B. A., Tolloczko, B., Martin, J. G., Grütter, P. Probing the Viscoelastic Behavior of Cultured Airway Smooth Muscle Cells with Atomic Force Microscopy: Stiffening Induced by Contractile Agonist. Biophysical Journal. 88, 2994-3007 (2005).
