Skivekulturer lette manipulationen af embryo udvikling ved gen og farmakologiske forstyrrelser. Dog skal dyrkningsbetingelser sikre, at normal udvikling kan fortsætte inden for det reducerede miljø skive. Vi illustrerer en protokol, der letter normal rygmarv udvikling kan fortsætte i mindst 24 timer.
Skivekulturer kan lette manipulation af embryo udvikling både farmakologisk og gennem gen manipulationer. I denne reduceret system kan potentielle letale bivirkninger som følge af systemisk lægemiddel ansøgninger overvindes. Dog skal dyrkningsbetingelser sikre, at normale udvikling fortsætter i den reducerede miljø i skive. Vi har fokuseret på udviklingen af rygmarven, og herunder af spinale motoriske neuroner. Vi varieres systematisk dyrkningsbetingelser for kyllingeembryofibroblaster skiver fra det punkt, hvor de fleste spinale motorneuroner var blevet født. Vi analyserede antallet og typen af motorneuroner, der overlevede i dyrkningsperioden og positionen af disse motorneuroner sammenlignet med in vivo. Vi fandt, at serum-type og neurotrofiske faktorer blev påkrævet under dyrkningsperioden og kunne holde motorneuroner i live i mindst 24 timer og tillade disse motorneuroner at migrere til passende positioner irygmarv. Vi præsenterer disse dyrkningsbetingelser og metoder til fremstilling af embryo skivekulturer hjælp udtaget kyllingeembryoner indlejret i agarose og skåret med en vibratome.
Under normal embryo udvikling, er mange forskellige celletyper genereret som skal migrere fra deres udgangspunkt, hvor de i sidste ende vil fungere i den modne organisme. Inden for den udviklende rygmarv, der progenitorceller placeret i den ventrikulære zone ved midterlinjen og generere mange undertyper af postmitotiske neuroner og gliaceller, der skal migrere til at integrere i funktionelle neuronale kredsløb er nødvendige for sensorisk forarbejdning og motorudgange 1. Spinal motoriske neuroner, der styrer kontraktion af lemmer muskler er blevet grundigt undersøgt, og meget er kendt af molekylerne og mekanismer, der driver dannelsen af deres forskellige underklasser. Imidlertid er langt mindre kendt af de mekanismer, der motorneuroner vandrer, adskille og modtage synaptiske input.
Motor neuron subtype identitet er erhvervet under udvikling i en hierarkisk måde. Motorneuron subtyper kan groft klassificeres inFor adskilte søjler, divisioner og puljer, som er defineret ved deres axon fremskrivninger. Motor kolonner projektet axoner til enten aksiale, viscerale eller lemmer muskler. Motor divisioner underinddele lemmet fremspringende motoriske neuroner i den laterale motor kolonne (LMC) i dem rager til ventrale eller dorsale muskler 2. Inden for de divisioner, kaldet klynger af motorneuroner motor puljer projekt til enkelte muskler i benet 2, 3. Limb-udragende motorneuroner er defineret ved deres ekspression af transkriptionsfaktor Foxp1 4, 5, medens udskilte identitet er kendetegnet ved ekspressionen af homeodomænet transkriptionsfaktorer Islet-1 (ventralt ragende) eller Lhx-1 (dorsalt ragende) 6. Faktisk er Lhx-1-ekspression krævet for den pågældende dorsale fremskrivninger af motorneuroner 7. Hver af disse undertyper indtager distinkte positioner i rygmarven, ventrale fremspringende motorneuroner kommer til at opholde sig medialt for dorsalt projecting motorneuroner. Dette resulterer i LMC blive opdelt i såkaldte LMCmedial (LMCm) og LMClateral (LMCl) divisioner. Divisional og motor pool organisation er erhvervet i to faser 8. I den første fase, der er divisionsdirektør adskillelse opnås via en migration af motoriske neuroner i en karakteristisk medialt for laterale mode. De LMCl celler genereres efter LMCm celler og så LMCl migrerer gennem LMCm at nå sin endelige bundfældning position. Den anden fase tager motorneuroner i en division og klynger dem i motorneuroner puljer, formentlig via en dorsal-ventral sortering af de motoriske neuroner. Medlemmer af catenin-afhængige klassiske cadherin familien har vist sig at være afgørende for begge faser af motorneuroner organisation 8-10. Men hvordan cadherin styrer cellebevægelse dårligt forstået.
Købet af kolonneformat, divisions-og pool identiteter kræver ekstrinsiske signaler, mønster intrinsic ekspression af transkriptionsfaktorer 11. Derudover har omkring 50% af alle motoriske neuroner dør via apoptose under normal udvikling i en proces, der kræver ekstrinsiske signaler fra lem, i vid udstrækning gennem neurotrof støtte til motor neuron overlevelse. Således motor neuron udvikling kræver det rette miljø kan opretholdes over en relativt lang tidsforløbet. Derfor kræver de praktiske forhold ved frembringelse rygmarven skivekulturer at opretholde motor neuron overlevelse belysning af passende dyrkningsbetingelser. Tidligere embryo skivekulturer er blevet anvendt til at følge adfærd extrinsically tilsat oprenset neuronpopulationer 12-14. Imidlertid har vores viden dyrkningsbetingelser, der letter in situ motor neuron overlevelse og migration inden for skive sig selv ikke er blevet offentliggjort. Vi modificeret en standardkultur tilstand, der letter overlevelse af oprenset, til dissocierede kraniale motorneuroner lette mOTOR neuron udvikling inden for et foster skive kultursystem. Vi har også overvåget positioneringen af de overlevende motoriske nerver og viser, at stort set normale positioner for motor neuron-område er opnået under dyrkningsperioden.
Protokollen beskrevet her tillader en kyllingefoster skive, der skal inkuberes i mere end en dag og samtidig holde motoriske neuroner i live og fortsætter med at migrere under dyrkningsperioden. I udredningen af betingelserne for at holde motorneuroner i live, har vi identificeret flere vigtige nødvendige funktioner. Det forekommer, at op til 4% chick serum er kritisk for overlevelsen af motorneuroner og afløst med serum fra en anden art ikke tolereres. Interessant nok fandt vi, at tilstedeværelsen af højere koncentrationer af serum var skadelige for skiverne som de fremmede overvækst af væv, der fører til grove forvridninger i udsnit form. Hvad vigtigere er, tilstedeværelsen af cilliary neurotrofisk faktor også vist sig kritisk. Det er en klar mulighed, at skiverne kan være i stand til at blive dyrket i betydeligt længere perioder end 24 timer, måske endda tillader visualisering af sensorisk afferent input til rygmarven. Derudover cultidige forhold her kan også være nyttigt at skære kulturer i udviklingslandene hjernestammen og midthjernen / cerebellum.
Måske den største potentiel fordel ved anvendelsen af disse skive kulturbetingelser er, at de letter mulighed for farmakologisk manipulering af proteinfunktion samtidig minimere potentialet for skadelige virkninger på resten af embryonet, såsom hjertet. Et stort antal inhibitorer og agonister af forskellige signalveje kan anvendes til at vurdere migrationen af forskellige spinale neuron undertyper og eventuelt deres virkning af dannelsen af lokale spinal kredsløb under udviklingen. Derudover nogle genetiske forstyrrelser af proteinekspression, såsom dem, der gør brug af siRNAs og morpholinogrupper oligonukleotider, lider under, at de kun kan indføres tidligt i udviklingen (på grund af begrænsninger i in ovo elektroporation procedurer) og virkningerne kun vare en kort periode time (typisk en dag). Vores skive kultur er startet på et senere tidspunkt, og giver mulighed for at bruge denne teknologi senere under udvikling på udskæring stadium for at se deres virkninger i den periode, kultur skive.
Den skive kultur protokollen kunne også gøre det muligt visualisering af både spinal motor neuron samt dorsal interneuron migration i realtid via time-lapse video mikroskopi. Dette kan opnås ved hjælp af fasekontrastmikroskopi under hvidt lys eller ved anvendelse af fluorescens-billeddannelse. Hvis den sidstnævnte teknik blev anvendt derefter indførelse af fluorescerende mærker er nødvendig. Dette kan opnås enten ved introduktion af fluorescerende farvestoffer, såsom Dil eller dio via enten retrograd mærkning af lemmet eller anterograd mærkning af ventriklen eller in ovo elektroporation af konstrukter til at drive fluorescerende proteiner i en undergruppe af neuroner.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Sharon prale for mange indsigtsfulde diskussioner og B. Novitch for den slags gave af antistofferne til Foxp1. Dette arbejde, som finansieres af en studentship fra Wellcome Trust til KCT og en projektbevilling fra Wellcome Trust til SRP (Grant referencenummer 094399/B/10/Z).
Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen’s eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
#5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
Super glue | Power Flex, Loctite | ||
Ethanol | SIGMA | 32221 | |
Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
Sucrose | SIGMA | S0389 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | |
Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25×60 mm |
Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |