Protozoa astarlanmış Bakteriler ile uysal Memeli Hücre Enfeksiyonlar
Summary
Bu teknik, önceki memeli hücrelerinin protozoal enfeksiyonlara karşı doğal ev sahibi hücrelerin önceden yetiştirilir bakteriyel patojenlerin hücre içi büyüme, hasat normalleştirmek ve ölçmek için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, sahne emiş hem de hedef hücre tipleri için konukçu hücrelerin geniş bir çeşitliliği için modifiye edilebilir.
Abstract
Birçok hücre içi bakteriyel patojenler. Ortamında yayılması için doğal bir rezervuar olarak tatlı su protozoans kullanmak Legionella pneumophila, Lejyoner pnömoni etkeni, ilk önce memeli makrofajlar enfeksiyonu protozoon hücre hasat İn vitro kültür bakterileri üzerinde patojenik avantaj kazanır. Bu önemli virülans faktörleri düzgün vitro ifade edilemez olabileceğini düşündürmektedir. Biz priming L. için uysal sistemi geliştirdik memeli hücre enfeksiyonu doğal protozoon ana Acanthamoeba castellanii aracılığıyla pneumophila öncesinde. Herhangi bir virülans faktörünün katkısı protozoon priming sonra yabani tip bakteri bir mutant suşunun hücre içi büyüme karşılaştırılarak incelenebilir. GFP-ifade eden vahşi tip ve mutant L. pneumophila suşlarının astar adımda protozoon monolayers bulaştırmak için kullanılan ve hücre içi büyüme evrelerinde ulaşmasına izin verilir. Floresan bakteriler daha sonra bu enfekte hücrelerden hasat ve memeli makrofajlar içine bir sonraki enfeksiyon bakteri karşılaştırılabilir sayılar üretmek için spektrofotometri ile normalize edilir. Miktar için, canlı bakteri floresan mikroskobu, akım sitometri ve koloni plaklamayla kullanarak enfeksiyonu sonrası takip edilmektedir. Bu teknik vurgular ve doğal bir edinim güzergah karşılaşılan olacağını ortamı taklit ederek konak hücre bağımlı gen ifadesinin katkısı dayanır. Bu yaklaşım bir patojen avantajı sağlamak için bir araç olarak aracılık konak kullanan herhangi bir bakterinin karşılamak için değiştirilebilir.
Introduction
Çok sayıda bakteriyel patojenler intrasellüler kabinindeki yaşam ve çoğaltma için konak hücreleri istismar genelleştirilmiş stratejiler adapte etmişlerdir. Birçok durumda, patojenik mekanizmaların protozoon ve metazoan hücreleri arasındaki benzer. Bununla birlikte, bu iki mikro çok farklı olan ve virülans faktörü 1-4 arasında farklı ifade neden olabilir. Lejyoner hastalığı bakterisi Legionella pneumophila ubiquitously 5 dünya çapında tatlı su ortamları ile ilişkilidir. Önemlisi, L. pneumophila organizmanın 6-8 ekili in vitro daha farklı bir protozoon hücre çıkmadan bakterinin küresel gen ekspresyon profilleri düşündürecek şekilde, insan monosit patojenik bir avantaj elde enfeksiyon öncesinde protozoon hücreleri yetiştirilmektedir. Doğada, tatlısu amipler istilacı bakterinin hızlı amplifikasyon için zengin besin sınırları sağlamaktadır. L. İnsan edinimi pneumophila çoğunlukla bakteri içeren kirli su damlacıklarının solunması atfedilir. Büyük olasılıkla bu damlacıkları liman protozoon hücre ilişkili bakteriler olduğunu; protozoon hücre konvansiyonel su arıtma uygulamaları 9,10 karşı daha dayanıklı olduğu. 11-13 protozoan konak hücreleri içinde hücre içi bakterilerin yaşam döngüsünün ile hemen hemen aynı şekilde, akciğer alveolar makrofaj ilerler enfeksiyonu.
Hayatta kalmak ve ökaryotik hücrelerde çoğaltmak için, L. pneumophila Nokta / Icm konak hücre 14-16 sitozolüne yaklaşık 300 'efektör' proteinleri teslim olarak adlandırılan özel bir türü IVb salgı sistemini kullanır. Bu efektör proteinleri topluca bakterinin 17,18 için bir çoğaltma müsamahakâr bölmesi oluşturmak amacıyla hücresel süreçleri yıkmak için çalışır. Hücre içi mult için arızalı suşunun Nokta / Icm taşıyıcı sonucu ihtiva 26 genlerin herhangi delesyonlarıiplication 19-23. Tarihsel olarak, bireysel efektör gen kodlama bölgesinin silinmesi nadiren hücre içi büyüme için zayıflatılmış bir suşu ile sonuçlanmıştır. Bu olgu gereksiz fonksiyon ve etkileyiciler paralogous kopyaları dahil olmak üzere birçok hipotez isnat edilmiştir.
Bazı virülans faktörü ancak konak hücre ile ilişkili hücre içi büyüme 24 bağlamında ifade edilmiştir. Bu, belirli bir efektör sadece protozoan enfeksiyonu bağlamında ifade edildi, daha sonra efektör katkısı hem in vitro olarak kültür edildi bir yabani tip soyla karşılaştırıldığında edilemeyeceğini rasyonalize. Bir replikatif bir aktarıcı aşamasına L. pneumophila geçişler bu kültür 25'de sabit faz girer gibi. Faz geçişi fenotipi intraselüler büyüme sırasında karşılaşılan ve motilite 26 kamçının montajı ile örneklendirilmiştir besin tükenmesi temsil eder. Çünkü L. pneumophila daha invaziv olanprotozoon hücre hasat zaman sive ve öldürücü, biz konak makrofajları karşılaştı daha sadık bakterinin patojen devletin temsil ettiği bir test geliştirmek için çalıştı.
Bu amaçla, ilk (priming hücre) ve ikinci (hedef hücre) evre enfeksiyonları için uygun herhangi bir ana karşılamak çok yönlü bir protozoon emişli analiz geliştirilmiştir. Enfeksiyon süreci istikrarlı bir şekilde yeşil floresan protein (GFP) eksprese bakterilerin kullanımı yoluyla uysal olduğunu. Protozoan Acanthamoeba castellanii için enfeksiyon modeli geniş alan 27 içinde kullanılan bir yöntem takip eder. Priming adım, L. için pneumophila suşlarının etiketli 'geçirgen' bakteri (Şekil 1A) üretmek için sıvı ortamda sabit faz in vitro yetiştirilmektedir. Bakteriler bir sonraki A. tek katmanlarını enfekte etmekte kullanıldığında castellanii 18 saat süreyle intrasellüler yaşam döngüsünün geç bir aşamasında elde etmek. Büyük vakuoller içerening bakterileri floresan mikroskobu (Şekil 1A) kullanarak bu kez noktada incelenebilir. Protozoan hücreler daha sonra lize edilir ve lizat alınan bakteri bir floresans plaka okuyucusu kullanılarak 512 nm'de emisyon için ölçülmüştür. Floresans hedef hücrelerin enfeksiyonu (Şekil 1, * Korelasyon Eğrisi) için çokluk-of-enfeksiyonu (İB) hesaplamak için optik yoğunluğu ile ilişkilidir. Invazyon (T 0) ve 18 saat işgal sonrası (T 18) sonra, hedef hücrelerin hücre içi bakteri temsil, floresan için ölçülür. Floresan mikroskobu ve akım sitometri ile izlenebilir, ve yaşayan sayı koloni sayesinde kaplama ölçülebilir. Astar assay hep wild-tip L. ile enfeksiyonların eşlik ediyor pneumophila ve Nokta / Icm tip IV sekresyon sistemi (Δ Dota) (Şekil 1A) kusurlu bir gerginlik. Bu önemlisi vahşi tip bir arasında doğrudan karşılaştırmalar için iç kontroller sağlarenfeksiyon işleminde kullanılan nd herhangi izogenik mutant soylar. Astarlama aşamasında avirulent Δ DotA suşu dahil in vitro kültürlenmiştir izogenik mutant soylar ile ilişkili olarak zayıflatılmış büyüme fenotipi gözlenmesi için bir eşik değeri belirler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriyel gen ekspresyonu sıkıca yaşam döngüsü ilerlemesi ve çevredeki mikroçevresindeki sinyallerine yanıt bir kombinasyonu yoluyla kontrol edilir. Böyle L. gibi vakuoler patojenler bir phagosome bölmesiz zaman pneumophila konak hücre kaynaklı işaretlerin bir sayıda yanıt verir. Konak hücre içinde besin tükenme kollektif bir sonucu olarak, bakteri, bir sonraki ana hücre 25 ile başarılı bir şekilde yayılması için gereken faktörler tarafından ifade dengeler. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz protozoon hücre enfeksiyonları için bir şablon sağlamak için Dr Craig Roy ve Dr Dario Zamboni ederim. Yazının eleştirel yaklaşım Dr Lulu Cambronne; Biz Dr Jagdeep Obhrai, Dr Georgiana Purdy, Dr Fred Heffron ekipman ve reaktifler için Todd Wisner ederim. Flow sitometri OHSU Akış Sitometri Paylaşımlı Kaynak tesisi yapıldı. Bu eser Oregon ve bir NIH hibe R21 AI088275 (EDC) Tıbbi Araştırma Vakfı tarafından bir bursla kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
Riferimenti
- Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues. Science. 259, 686-688 (1993).
- Mahan, M. J., et al. Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).
- Rankin, S., Isberg, R. R. Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment. Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).
- Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth. Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).
- Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).
- Cirillo, J. D., et al. Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila. Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).
- Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion. Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).
- Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages. Front Microbiol. 2, 60 (2011).
- Kilvington, S., Price, J. Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).
- King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).
- Horwitz, M. A. Formation of a novel phagosome by the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes. J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).
- Horwitz, M. A. Phagocytosis of the Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil. Cell. 36, 27-33 (1984).
- Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. Legionnaires’ disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes. J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).
- Burstein, D., et al. Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach. PLoS Pathog. 5, e1000508 (2009).
- Zhu, W., et al. Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila. PLoS One. 6, e17638 .
- Nagai, H., Kubori, T. Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria. Front Microbiol. 2, 136 (2011).
- Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).
- Shin, S., Roy, C. R. Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila. Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).
- Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).
- Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).
- Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).
- Segal, G., Shuman, H. A. Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila. Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).
- Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279, 873-876 (1998).
- Haghjoo, E., Galan, J. E. Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi. Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).
- Molofsky, A. B., Swanson, M. S. Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).
- Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila. Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).
- Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation. Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).
- Neild, A. L., Roy, C. R. Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation. Immunity. 18, 813-823 (2003).
- Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens. Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).
- Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA. Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).
