La valutazione di svuotamento gastrico in non-obesi topi diabetici utilizzando un [¹³ C]-ottanoico Breath Test Acid

Summary

Determinazione di svuotamento gastrico con un non-invasiva [¹³ C]-ottanoico breath test con acido per gastroparesi inseguimento in femmine di topo NOD LTJ.

Abstract

Gastrico studi svuotamento nei topi sono stati limitati dalla incapacità di seguire i cambiamenti di svuotamento gastrico, nello stesso animale, poiché le tecniche più comunemente utilizzate richiedono l'uccisione degli animali e il recupero post-mortem del ^1,2 pasto. Questo approccio evita studi longitudinali per determinare le variazioni di svuotamento gastrico con l'età e la progressione della malattia. Il comunemente usato ^[13 C]-ottanoico breath test con l'acido per l'uomo ³ è stato modificato per l'uso nel topo e nel ratto ^{4-6 7} e abbiamo precedentemente dimostrato che questo test è affidabile e sensibile alle variazioni di svuotamento gastrico in risposta ai farmaci e durante progressione di malattia diabetica ^8. In questo video di presentazione il principio e l'attuazione pratica di questo test modificato è spiegato. Come nel precedente studio, i topi NOD LTJ vengono utilizzati, un modello di diabete di tipo 1 ^9. Una quota di questi topi sviluppano i sintomi di gastroparesi, una complicazione di Diabetees caratterizzata da ritardato svuotamento gastrico senza ostruzione meccanica dello stomaco ^10.

Questo documento dimostra come addestrare i topi per i test, come preparare il pasto di prova e ottenere 4 ore di dati di svuotamento gastrico e come analizzare i dati ottenuti. L'analizzatore isotopo di carbonio utilizzati nel presente studio è adatto per il campionamento automatico dei campioni di aria da un massimo di 12 topi contemporaneamente. Questa tecnica permette di follow-up longitudinale di svuotamento gastrico da grandi gruppi di topi con diabete o altre malattie di lunga durata.

Introduction

Questo manoscritto descrive le considerazioni tecniche e metodologiche implicate nella misurazione non invasiva di svuotamento gastrico nei topi. Seguendo il protocollo qui descritto, gli investigatori in modo affidabile e riproducibile seguire le modifiche di svuotamento gastrico a causa dello sviluppo della malattia, studiare l'impatto di agenti farmacologici sullo svuotamento gastrico e seguire la risposta di svuotamento gastrico per il trattamento di malattie sottostanti o difetti ^{6,8, 11,12.} In precedenti pubblicazioni, l'applicazione di ¹³ C test di respiro acido ottanoico ha dimostrato di essere un modo utile per misurare svuotamento gastrico nell'uomo e negli animali ^3,8. Questo documento descrive in dettaglio, le procedure necessarie per ottenere dati affidabili sul 6-8 mesi necessari per uno studio longitudinale di svuotamento gastrico nei topi con diabete. I vantaggi di seguire questo protocollo rispetto ai metodi precedentemente pubblicati sono che il ricercatore può essere assicurato il richiederlo datid sarà affidabile e riproducibile. Inoltre, il sistema automatizzato per la raccolta e l'analisi dei campioni di gas descritto qui aumenta il numero di animali che possono essere seguiti simultaneamente in uno studio. Nel complesso, l'obiettivo di questo lavoro è quello di identificare i fattori chiave che mantengono assuefazione dei topi al test e che ridurre la variabilità nei risultati ottenuti.

Per la misurazione in vivo di svuotamento gastrico, i topi sono tenuti a digiuno per una notte e messo nelle camere di prova di plastica trasparente con portata costante. Dopo i topi vengono abituati ai tubi, al basale esalato ¹³ CO ₂ livelli sono determinati e flusso d'aria adeguato di conseguenza. Successivamente, l'amministrazione di un pasto di prova costituito da tuorlo d'uovo mescolato con ¹³ C-marcato acido ottanoico. Poiché i topi a digiuno e formati, in genere mangiare il pasto di prova entro 2 minuti. Il somministrato acido ottanoico non viene assorbito nello stomaco, ma sarà ripreso nel duodeno und otterrà metabolizzato nel fegato in ¹³ CO _2, che viene rilasciato ed espirata, con un conseguente arricchimento di ¹³ CO _{2 nell'aria} circostante. Campioni d'aria sono raccolti ad intervalli di tempo determinati ed analizzati mediante l'analizzatore degli isotopi di carbonio. Il rate-limiting passo in questo processo è lo svuotamento gastrico e l'escrezione polmonare di ¹³ CO ₂ corrisponde direttamente con lo svuotamento gastrico del pasto marcato.

Figura 1. Schema dell'apparato svuotamento gastrico. Dopo il digiuno notturno, i topi sono posti in camere trasparenti, che consentano loro di muoversi e girare liberamente. Un tubo di ingresso permette afflusso di aria fresca e costante ed una uscita conduce l'analizzatore per misurare l'isotopo ^{13 C-a-12}Rapporto C nel respiro esalato. La camera dispone anche di una porta centrale per la consegna di prodotti alimentari contenenti ^[13 C]-acido ottanoico.

Protocol

1. Formazione e assuefazione dei Topi Prima dell'analisi, mettere tutti i topi nelle camere di prova per 2-4 ore con flusso d'aria costante, al fine di abituarli alle condizioni di prova. Questo riduce notevolmente i livelli di stress che altrimenti potrebbero causare il rilevamento aberrante di ritardato svuotamento gastrico. Trattare i topi stesso modo se l'esperimento svuotamento gastrico è in esecuzione. Preparare il tuorlo d'uovo (vedi oltre), senza l'aggiunta di acido ottanoico e al…

Representative Results

A dati rappresentativi indicati da tre topi diverse è mostrato in Figura 2. Il grafico nero rappresenta i punti dati di un mouse con svuotamento gastrico normale. Essa mostra la frazione di 13 C che viene recuperato in aria espirata espressa come percentuale della dose somministrata per ora espressa come funzione di tempo. La curva blu è da un topo con un accelerato svuotamento gastrico con un valore di mezzo T di 40 min e la curva rossa è da un mouse con svuotamento gastrico ritardato con…

Discussion

La tecnica qui descritta permette di ripetuti e non invasivo per la misurazione in vivo di svuotamento gastrico solido nei topi. Questo sistema ha il vantaggio che gli animali non sono trattenuti nella camera di misura, permettendo loro di muoversi e ruotare liberamente. Dal momento che questo è un ambiente familiare, i topi hanno ancora bisogno di essere addestrati e abituati alle camere di prova per prevenire gli effetti dello stress sullo svuotamento gastrico. In generale, si assume i dati svuotame…

Materials

NAME	COMPANY	CAT NUMBER	COMMENTS
A source of constant air-supply, flow as well as composition	central air supply in the research facility
130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply	In-house built
Octanoic acid	Cambridge isotope laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
To prepare the egg meal: small beaker 50 ml plastic tube Bunsen burner egg spatula	Any supplier		Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal
Carbon dioxide isotope analyzer	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)