直接成像诱导ER钙有针对性的酯酶染料装载（TED）

Summary

有针对性的酯酶诱导染料吸附量（TED）支持通过荧光成像分析细胞内钙库动态。该方法的基础上针对重组羧酸酯酶的内质网（ER），在那里它提高了合成的低亲和性钙本地揭露⁺指示剂染料在ER腔。

Abstract

重要的是要了解钙的作用在细胞生理钙动态的可视化。要检查钙动力学，合成的Ca ^{2 +}荧光指示：已成为流行。在这里，我们展示了TED（=有针对性的酯酶诱导染料吸附量），一种方法来提高释放的Ca ^{2 +}指示剂染料在不同类型的细胞内质网腔。迄今为止，TED在细胞系，神经胶质细胞和神经元在体外使用。 TED快递羧酸酯酶（CES）的基础上高效，重组目标高羧酸酯酶活性使用载体构建到内质网腔。最新的TED载体包含CES2红色荧光蛋白融合的核心要素，从而使两色同时成像。在ER中的游离钙离子的动态成像的一种颜色，而相应的ER​​结构以红色显示。的程序开始时，用慢病毒转导细胞。随后，受感染的细胞重新接种于盖玻片终于使活细胞成像的。然后，活细胞培养与乙酰甲酯（AM -酯）的形式，低亲和力的Ca ^{2 +}指标，例如，MAG-Fluo4-AM Fluo5N-AM或MAG Fura2的调幅。在ER内酶切关闭从AM的Ca ^{2 +}指示剂和亲水性荧光染料/ Ca ^{2 +}的复合物形式的疏水性侧链的酯酶活性的内质网腔中形成并聚集。染料吸附量后，将细胞在一个倒置的共聚焦激光扫描显微镜分析。细胞连续灌流林格类似的解决方案和ER钙动力学直接可视化的时间推移成像。从内质网的钙离子的释放是确定的感兴趣区域的荧光强度下降，ER钙库的再填充而产生的荧光强度的增加。最后，荧光强度随时间的变化ΔF/ F ₀通过计算确定。

Introduction

为了解决ER钙的生理反应，我们开发了一个新的策略，以提高合成钙敏感染料进入ER诱捕。该方法能够直接的，非破坏性的实时监控自由ER钙在细胞外钙离子的存在。

ER钙的功能和信令

钙信号被发现的不同类型的细胞， 如肌肉细胞，神经元和神经胶质细胞，其功能范围从调解肌肉收缩，参与突触传递的学习和记忆^1,2。游离钙离子浓度的变化有很高的科学价值，因为钙参与调节基因转录，细胞增殖，神经细胞的兴奋性，细胞死亡和其他细胞信号事件^1-7。所有这些细胞钙信号连接功能，并有助于细胞内钙存储动态^8-10。

所有的钙信号中的一个共同特点是钙外空间之间的流动，细胞质和细胞器，主要是ER和线粒体。这会导致这些细胞器内的钙离子浓度的动态变化，由不同的信令组件感测。一般情况下，内质网中的钙浓度的范围在100至800微米之间，在细胞质中的钙离子浓度接近100纳米，和在细胞外空间中的浓度大约是1-2毫米。因此，存在很高的化学驱动力细胞质中的钙离子流向^2,9,10。

最常研究的ER-源性钙信号依赖于G-蛋白偶联受体（GPCR），然后激活磷脂酶C（PLC）的刺激。反过来，PLC在生产肌醇1,4,5 -三磷酸肌醇（IP _^3）1。 IP ₃结合后其REC在ER膜的eptor（IP _3， 图1（记录）），钙离子从内质网腔中释放。在历史上，第一_IP-3介导从内质网释放钙-间接即使-测量胰腺腺泡细胞由Streb 等的。于1983年^11。此出版物建议在第一次涉及乙酰胆碱，磷脂酶C和IP _3的信号级联。这种方式的钙离子的释放一般被称为IP ₃引起的钙离子的释放（IiCR）（ 图1）。依赖激酶激活磷脂酶Cγ受体酪氨酸激酶生长因子和神经营养因子的作用ER钙信号后IP海拔₃ ^12。钙海拔在除了IiCR，可介导的离子型钙条目，例如兰尼再通过电压门控钙通道（CA _V），以及随后的钙诱导钙释放（CICR）与其受体（RyR的）。 IiCR和CICR生理链接库操纵的钙进入（SOCE）。 SOCE包括STIM（基质相互作用的分子），这是一个传感器，用于ER钙离子释放的动作。激励信号已被证明，通过瞬时受体电位通道色氨酸^{（Trp），13，14} Orai钙离子通道和电压门控钙离子通道^15（ 图1）刺激细胞外钙离子条目。 ER钙丢失是动态救出由的肉瘤内质网钙ATP酶（SERCA），积极的泵钙背到急诊室的作用。阻断药物，如毒胡萝卜素SERCA ER钙胞质室推出了一个连续亏损。该ER钙“泄漏”Sec61蛋白复合物^16,17（ 图1）配合物，如ER膜内孔隙所造成的。

贝里奇1998年，出版了一本模型中，“神经元内的神经元模型”，这ħ建议的原则生理作用的ER结合神经元钙^5。该模型认为，存在一个连续的的ER膜系统形成一个细胞内的“形象”的神经细胞质膜^5。这个二进制真核生物膜系统是自称是快与慢的神经元钙信号的时间与空间整合的基本前提。钙信号发生随之而来，随后在不同的相同的神经元树突棘或赋予细胞的胞体或细胞核通过急诊室，在那里他们总结了^5,18。然后，其总和可能会影响神经元的兴奋性，调节基因转录或集成的信号级联。因此，ER支持钙信号的整合。这一概念的一个先决条件是所声称的一些研究，并已被证明至少为躯体-D在单个细胞中的雌激素受体的连续性endritic地区和短距离轴突预测^19-21。是否有内长轴突预测ER连续性是一个有争议的问题。

来测量其流量超过ER膜游离钙的战略

钙信号的最频繁监测在细胞质中^22,23。因此，它可以很容易地区别是否的Ca ^{2 +}流进入细胞质从细胞外或细胞内储存^6,24。为了克服这个限制，方法策略直接ER钙成像已经制定出来。总之，使用下列策略：（1）ER-针对性的基因工程蛋白质指标^25-27。基于蛋白质的低亲和力的Ca ^{2 +}的指标，使用的生物发光蛋白水母发光蛋白结合钙传感蛋白或GFP。这些基因工程的Ca ^{2 +}的指标（GECIS）定位到内质网的信号肽的帮助下，积极地保持在ER中使用的保留和检索动机。常见的ER的Ca ^{2 +}指标上卡梅里安原则基础卡默莱昂YC4.3 ^{26,28; 29}分裂YC7.3ER卡梅里安，卡梅里安D1 ^30。 （2） 直接酯酶基染料装载AM酯低亲和力的Ca ^{2 +} 指标 ^31,32 AM衍生工具的指示剂染料（MAG-Fura2-AM，MAG-Fluo4-AM-AM Fluo5N）通过生物膜的亲脂性，钙不敏感的状态。然后，在细胞质中，以及在ER中，内源性酯酶对AM-酯基裂开，释放的Ca ^{2 +}指示剂，留下一定量的活性染料在细胞质中，在ER。因此，这种方法在ER中的钙离子浓度高的条件下是有用的，只要细胞内游离钙离子的浓度保持低于去低亲和性的指标的TECTION限制，特别是在特征钙信号（ 例如，纳米低μM）。 （3）AM酯组合质膜通透性³²加载，任何剩余的胞浆Ca ^{2 +}指示剂除去质膜通透性与少量的“温和”的清洁剂（ 例如皂甙）在人工细胞内的缓冲。因此，细胞内的膜的可能的刺激， 例如 ，与在细胞内的缓冲液中的IP _3，可直接通过质膜中的“孔”。 （4） 胞液中透析，根据全细胞配置和同时测量的Ca ^{2 +}在ER腔体和的胞质溶胶^32,33。细胞被第一次装载有低亲和力的Ca ^{2 +}的指示器（ 例如，幅度- Fura2上午，比例，UV光）。之后，与帮助的补丁吸管，任何其它细胞色素osolic低亲和性的Ca ^{2 +}指示剂透析的胞液中的缓冲液含有高亲和力的Ca ^{2 +}的指示器（ 例如萤光-3，可见光）。这一战略使细胞质和ER派生的信号同步记录。 （5） 目标酯酶诱导染料加载 ^8,34。甲羧酸酯酶（CES）上被定位到内质网的内腔中，并提供了一个高的酯酶活性对AM-酯的形式存在的低亲和力的Ca ^{2 +}的指标的有效捕获。

有针对性的酯酶诱导染料吸附量（TED）

为了提高针对低亲和力的Ca ^{2 +}的指标内质网腔，TED的开发。 TED需要一个ER靶向小鼠羧酸酯酶（CES2）（ 图2），这是实现通过表达构建的过表达。对AM-酯的形式存在的钙孵育细胞表达重组CES构造的dicator染料（Fluo5N-AM， 图2）。然后，在ER中，染料被转换到的Ca ^{2 +}敏感的，不透膜的Ca ^{2 +}指示剂络合物（Fluo5N/Ca ^{2 +）的}高的酯酶活性，因此，捕获的内质网腔⁸中以高浓度的染料^，34。该方法是特别有用的调查通过IiCR途径例如雌激素受体 ​​的钙释放，通过代谢，嘌呤或谷氨酸受体^8,34和可视化ER钙耗竭后，在SERCA ^17的封锁，通过“泄漏通道”，例如直接^，34。据我们的经验，低亲和力的Ca ^{2 +}指标Fluo5N-AM是目前最好的可用指标，使用TED的染料加载策略。 Fluo5N-AM具有低亲和力的Ca ^{2 +（}解离常数_K D〜90微米， 图2），其AM-形式几乎无荧光，但提供高荧光发射后calciu米^8,34约束力。 〜490 nm处，对应于标准染料如FITC标记的Alexa 488，或绿色荧光蛋白与一个标准的光源，可兴奋的Fluo5N/Ca ^{2 +}配合物。细胞内钙信号几乎达到在低浓度μM范围内，因此，几乎没有检测到在细胞质中Fluo5N ^35。

为了提高的TED性能，开发一些重组载体构建（ 图3）。本来，式载体的基础上的编码序列（RefSeq的登记号为NM_145603，CES2c CES2）和最佳的TED性能是观察到与CES的结构稳定表达。新TED载体表达红色荧光蛋白TagRFP-T2 ³⁶ CES2融合的核心要素。这些载体的优点是，它们可以被用来识别转导的细胞，使用的红色荧光变化的归一化在Fluo5N/Ca ²作为内部控制⁺荧光。红色荧光还提供了可能性，以可视化的刺激条件下的ER和ER动态变化的结构分布。

Protocol

该协议介绍TED应用细胞株，海马神经元及大脑皮质神经胶质细胞。 TED性能最好的时候，TED向量稳定表达，例如慢病毒载体。 TED的方法在图4中所示的示意性概观。 1。溶液的制备开始之前，应准备以下的解决方案，并可以被存储为指示。我们通常使用的玻璃和塑料材料和无菌水消毒。 准备HEPES林格（毫米）：125氯化钠，氯化钾，25 HEPES…

Representative Results

该协议提供了一种非破坏性的方法，免费的ER钙的直接成像。低亲和性的合成的Ca 2 +释放指标被困于内质网腔的帮助下，一个对象的ER，重组酯酶的酶的活性。改进ER钙库动态加载的Ca 2 +指示剂染料的内质网腔，实现了直接和快速成像。 TED的细胞类型该方法的可行性已被证明在细胞系BHK21，HEK293 34，HeLa细胞17，SH-SY5Y，星形胶?…

Discussion

TED的方法的优点和缺点已进行了广泛的讨论，在最近的出版物^34,35。 TED情况下，与上述的其他方法相比，细胞破坏和灌注的问题。此外，需要强调两个方面。 TED ER钙成像的原则要求（1）目标TED的载体构建的帮助下，内质网腔，和（2）的高效率和低亲和力的合成AM酯优先释放活性羧酸酯酶表达内质网腔的钙染料。

1。 TED载体构建

图3总?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham’s F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
			Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.