लक्षित-esterase साथ ईआर कैल्शियम की प्रत्यक्ष इमेजिंग प्रेरित डाई लोड हो रहा है (टेड)
Summary
लक्षित-esterase प्रेरित डाई लोड हो रहा है (टेड) प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा intracellular कैल्शियम की दुकान गतिशीलता के विश्लेषण का समर्थन करता है. विधि यह सिंथेटिक कम आत्मीयता सीए की स्थानीय अनमास्किंग को बेहतर बनाता है जहां जालिका (ईआर), के लिए एक पुनः संयोजक Carboxylesterase के लक्ष्य पर कुर्सियां<sup> 2</supईआर लुमेन में> सूचक रंजक.
Abstract
कैल्शियम की गतिशीलता के दृश्य सेल फिजियोलॉजी में कैल्शियम की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. कैल्शियम की गतिशीलता की जांच, सिंथेटिक फ्लोरोसेंट सीए 2 + indictors लोकप्रिय हो गए हैं. यहाँ हम टेड (= लक्षित-esterase प्रेरित डाई लोड हो रहा है), 2 सीए की रिहाई में सुधार करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन + विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के ईआर लुमेन में सूचक रंजक. तिथि करने के लिए, टेड सेल लाइनों, glial कोशिकाओं, और इन विट्रो में न्यूरॉन्स में इस्तेमाल किया गया था. वेक्टर निर्माणों का उपयोग कर ईआर लुमेन के लिए एक उच्च carboxylesterase गतिविधि को निशाना कुशल, पुनः संयोजक पर टेड ठिकानों कि एक्सप्रेस Carboxylesterases (CES). नवीनतम टेड वैक्टर इस प्रकार एक साथ दो रंग इमेजिंग सक्षम करने, एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े हुए CES2 के एक प्रमुख तत्व होते हैं. इसी ईआर संरचना लाल रंग में दिखाई देता है, जबकि ईआर में मुक्त कैल्शियम की गतिशीलता, एक रंग में imaged हैं. प्रक्रिया की शुरुआत में, कोशिकाओं एक lentivirus साथ transduced रहे हैं. बाद में, संक्रमित कोशिकाओं को एकफिर अंत में जीना सेल इमेजिंग सक्षम करने के लिए coverslips पर वरीयता दी गई. फिर, जीवित कोशिकाओं acetoxymethyl एस्टर (AM-एस्टर) कम आत्मीयता 2 सीए के फार्म के साथ incubated रहे हैं + संकेतक, उदाहरण के लिए Fluo5N-PM, पत्रिका Fluo4-PM, या पत्रिका Fura2-AM. सीए 2 + सूचक और एक हाइड्रोफिलिक फ्लोरोसेंट डाई / सीए 2 + परिसर का AM रूप से हाइड्रोफोबिक पक्ष श्रृंखला बंद ईआर cleaves में esterase गतिविधि का गठन और ईआर लुमेन में फंस गया है. डाई लोड करने के बाद, कोशिकाओं एक औंधा लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग में विश्लेषण कर रहे हैं. कोशिकाओं लगातार घंटी की तरह समाधान के साथ perfused और ईआर कैल्शियम गतिशीलता समय चूक इमेजिंग द्वारा सीधे कल्पना कर रहे हैं कर रहे हैं. ईआर कैल्शियम की दुकान के refilling प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि पैदा करता है जबकि ईआर से कैल्शियम रिहाई, हित के क्षेत्रों में प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी के द्वारा की पहचान की है. अंत में, समय के साथ फ्लोरोसेंट तीव्रता में परिवर्तन ΔF / एफ 0 की गणना के द्वारा निर्धारित किया जाता है.
Introduction
ईआर के शारीरिक कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को हल करने के लिए, हम ईआर में सिंथेटिक कैल्शियम संवेदनशील रंगों के फँसाने सुधार करने के लिए एक नई रणनीति विकसित की है. विधि कोशिकी कैल्शियम की मौजूदगी में मुक्त ईआर कैल्शियम की प्रत्यक्ष, गैर विघटनकारी वास्तविक समय की निगरानी में सक्षम बनाता है.
ईआर कैल्शियम के फंक्शन और संकेत
कैल्शियम संकेतों को विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, जैसे मांसपेशियों की कोशिकाओं, न्यूरॉन्स और सीखने और स्मृति 1,2 में synaptic प्रसारण में शामिल होने की मांसपेशियों में संकुचन मध्यस्थता से glial कोशिकाओं और उनके कार्यों रेंज में पाए जाते हैं. कैल्शियम जीन प्रतिलेखन, सेल प्रसार, neuronal excitability, कोशिका मृत्यु और घटनाओं 1-7 संकेत अन्य सेल के विनियमन में शामिल है क्योंकि मुक्त कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन उच्च वैज्ञानिक रुचि के हैं. इन सभी सेलुलर कैल्शियम संकेतों कार्यात्मक जुड़ा हुआ है और कैल्शियम intracellular में योगदान कर रहे हैंदुकान गतिशीलता 8-10.
सभी कैल्शियम संकेतों के बीच एक आम सुविधा बाह्य अंतरिक्ष के बीच कैल्शियम के प्रवाह, cytosol और organelles है, मुख्य रूप से ईआर और mitochondria है. यह अलग संकेत घटकों द्वारा महसूस कर रहे हैं जो इन organelles के भीतर कैल्शियम एकाग्रता में गतिशील परिवर्तन का कारण बनता है. सामान्य तौर पर, 100-800 माइक्रोन के बीच ईआर पर्वतमाला में कैल्शियम एकाग्रता, cytosol में कैल्शियम एकाग्रता के करीब 100 एनएम है, और बाह्य अंतरिक्ष में एकाग्रता 1-2 मिमी के आसपास है. तदनुसार, साइटोसॉल 2,9,10 की ओर कैल्शियम प्रवाह के लिए एक उच्च रासायनिक प्रेरणा शक्ति है.
सबसे अधिक जांच की ईआर व्युत्पन्न कैल्शियम संकेत तो phospholipase सी (पीएलसी) को सक्रिय जो जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCR), की उत्तेजना पर निर्भर करते हैं. बदले में पीएलसी inositol 1,4,5-trisphosphate (आईपी 3) 1 पैदा करता है. इसके आरईसी के लिए आईपी 3 के बंधन परeptor (आईपी 3 आरईसी, चित्रा 1) ईआर झिल्ली में, कैल्शियम आयनों ईआर लुमेन से जारी कर रहे हैं. ऐतिहासिक, ईआर से आईपी 3 की मध्यस्थता कैल्शियम रिहाई पहला था – भले ही परोक्ष रूप से – Streb एट अल द्वारा कोष्ठकी अग्नाशय कोशिकाओं में मापा 1983 11 में.. इस प्रकाशन के लिए पहली बार सुझाव दिया acetylcholine, phospholipase सी, और आईपी 3 से जुड़े एक संकेत झरना. कैल्शियम की रिहाई के इस तरह आम तौर पर आईपी 3 प्रेरित कैल्शियम रिहाई (IiCR) (चित्रा 1) करार दिया है. रिसेप्टर tyrosin kinases लिंक आईपी 3 ऊंचाई 12 के बाद संकेत ईआर कैल्शियम के लिए वृद्धि कारकों और neurotrophic कारकों की कार्रवाई से phospholipase Cγ के kinase पर निर्भर सक्रियण. IiCR के अलावा, कैल्शियम ऊंचाई ryanodine फिर से वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल (सीए वी), और बाद में कैल्शियम प्रेरित कैल्शियम रिहाई (CiCR) के माध्यम से उदाहरण के लिए, ionotropic कैल्शियम प्रविष्टि द्वारा मध्यस्थता हो सकती हैceptors (RyR). IiCR और CiCR physiologically दुकान संचालित कैल्शियम प्रविष्टि (SOCE) से जुड़े होते हैं. SOCE ईआर कैल्शियम रिहाई के लिए एक सेंसर है जो STIM (स्ट्रोमा बातचीत अणु) की कार्रवाई भी शामिल है. STIM क्षणिक रिसेप्टर संभावित चैनल (टीआरपी) 13, उरई कैल्शियम चैनल 14 और यहां तक कि वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल 15 (चित्रा 1) के माध्यम से बाह्य कैल्शियम प्रवेश को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है. ईआर कैल्शियम की हानि गतिशील जो सक्रिय रूप से पंप कैल्शियम वापस ईआर में सारको-जालिका कैल्शियम ATPase (SERCA) की कार्रवाई से बचाया है. ऐसे thapsigargin के रूप में दवाओं के साथ SERCA अवरुद्ध साइटोसोलिक डिब्बे में ईआर कैल्शियम की एक निरंतर हानि का खुलासा किया. इस ईआर कैल्शियम "लीक" ऐसे Sec61 प्रोटीन जटिल 16,17 (चित्रा 1) के रूप में ईआर intramembrane ताकना परिसरों के कारण होता है.
1998 में, Berridge एक मॉडल, "एक न्यूरॉन मॉडल भीतर न्यूरॉन", जो प्रकाशितज न्यूरोनल कैल्शियम 5 एकीकृत करने में ईआर के एक सिद्धांत शारीरिक भूमिका का पता चलता है. इस मॉडल न्यूरोनल प्लाज्मा झिल्ली 5 के एक intracellular "छवि" बनाने की एक सतत ईआर झिल्ली प्रणाली के अस्तित्व को मानता है. इस द्विआधारी यूकेरियोटिक झिल्ली प्रणाली न्यूरॉन्स में तेज और धीमी कैल्शियम संकेतों के अस्थायी और स्थानिक एकीकरण के लिए एक बुनियादी शर्त होने का दावा किया गया था. एक ही न्यूरॉन के विभिन्न कांटा या dendrites में समन्वित रूप से या बाद में या तो होती है कि कैल्शियम संकेतों सेल की सोमा या वे 5,18 अभिव्यक्त किया जाता है जहां ईआर, के माध्यम से नाभिक को सम्मानित किया जाता है. फिर, अपनी राशि cascades संकेत के जीन प्रतिलेखन या एकीकरण के न्यूरॉन, विनियमन के excitability पर प्रभाव पड़ सकता है. इस प्रकार, ईआर कैल्शियम संकेतों के एकीकरण का समर्थन करता है. इस अवधारणा के लिए एक शर्त कई अध्ययनों से दावा किया गया है जो और कम से कम शारीरिक अथवा मानव शरीर संबंधी अर्थ में समास रूप घ के लिए सिद्ध किया गया है जो एक ही सेल में ईआर की निरंतरता हैendritic क्षेत्रों और कम दूरी axonal अनुमानों 19-21. लंबे axonal अनुमानों के भीतर ईआर निरंतरता है कि क्या वहाँ बहस का विषय है.
ईआर झिल्ली से अधिक मुक्त कैल्शियम के प्रवाह को मापने के लिए रणनीतियाँ
कैल्शियम संकेतों सबसे अक्सर साइटोसॉल 22,23 में निगरानी कर रहे हैं. इसलिए, यह आसानी से सीए 2 + कोशिकी से या 6,24 इंट्रासेल्युलर दुकानों से cytosol में बह रही है कि क्या प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है. इस सीमा को पार करने के लिए, प्रत्यक्ष ईआर कैल्शियम इमेजिंग के लिए पद्धति रणनीतियों विकसित किया गया है. सारांश में, निम्नलिखित रणनीति इस्तेमाल कर रहे हैं: (1). अनुवांशिक इंजीनियर प्रोटीन संकेतक 25-27 प्रोटीन आधारित कम आत्मीयता सीए 2 + संकेतक एक कैल्शियम संवेदन प्रोटीन के साथ संयोजन में bioluminescent प्रोटीन aequorin या GFP उपयोग ईआर को निशाना बनाया. इन अनुवांशिक इंजीनियर सीए 2 + संकेतक (GECIs सकते हैं)एक संकेत पेप्टाइड की मदद से ईआर के लिए लक्षित किया और सक्रिय रूप से एक अवधारण और पुनर्प्राप्ति आकृति का उपयोग कर ईआर में रखा जाता है. Cameleon विभाजन YC7.3ER 29, और Cameleon डी 1 30, और Cameleon सिद्धांत पर आम ईआर सीए 2 + संकेतक आधार Cameleon YC4.3 26,28 हैं. AM-एस्टर कम आत्मीयता सीए 2 (2) के प्रत्यक्ष esterase आधारित डाई लोड + संकेतक 31,32. सूचक रंगों के (पत्रिका Fura2-PM, पत्रिका Fluo4-AM या Fluo5N-AM) डेरिवेटिव AM पारित एक lipophilic, कैल्शियम असंवेदनशील राज्य में जैविक झिल्ली. फिर, cytosol में के रूप में अच्छी तरह से ईआर में, अंतर्जात esterases हूँ एस्टर समूह की फोड़ना और cytosol में सक्रिय डाई की एक निश्चित राशि के पीछे और ईआर में छोड़ने, सीए 2 + सूचक जारी है. साइटोसोलिक कैल्शियम एकाग्रता अच्छी तरह से डी नीचे रहता है इसलिए, इस दृष्टिकोण लंबे समय के रूप में ईआर में एक उच्च कैल्शियम एकाग्रता की परिस्थितियों में उपयोगी हैविशेष रूप से विशेषता कैल्शियम संकेतों (कम माइक्रोन के लिए जैसे एनएम) के दौरान कम आत्मीयता संकेतक के tection सीमा,. प्लाज्मा झिल्ली permeabilization के 32 के साथ संयोजन में (3) हूँ एस्टर लोड हो रहा है. कोई शेष साइटोसोलिक सीए 2 + सूचक एक कृत्रिम इंट्रासेल्युलर बफर में एक "मामूली" डिटर्जेंट (जैसे सैपोनिन) की थोड़ी मात्रा के साथ प्लाज्मा झिल्ली permeabilization के द्वारा हटा दिया जाता है. इस प्रकार, intracellular झिल्ली सीधे प्लाज्मा झिल्ली में "pores के माध्यम से", इंट्रासेल्युलर बफर में आई पी 3 के साथ जैसे को प्रेरित किया जा सकता है. (4) 2 सीए के पूरे सेल विन्यास और एक साथ माप के तहत साइटोसॉल की डायलिसिस + ईआर लुमेन और साइटोसॉल 32,33 में. एक सेल पहले एक कम आत्मीयता सीए 2 + सूचक (जैसे पत्रिका Fura2 के साथ भरी हुई है PM,), ratiometric यूवी प्रकाश. बाद में, एक पैच पिपेट, किसी भी शेष CYT की मदद सेosolic कम आत्मीयता सीए 2 + सूचक एक उच्च आत्मीयता सीए 2 + सूचक (जैसे Fluo-3, दृश्य प्रकाश) से युक्त एक बफर के साथ साइटोसॉल के बाहर dialysed है. इस रणनीति साइटोसोलिक और ईआर व्युत्पन्न संकेतों के साथ रिकॉर्डिंग के लिए सक्षम बनाता है. (5) लक्षित-esterase प्रेरित डाई लोड 8,34. एक Carboxylesterase (CES) ईआर के लुमेन के लिए लक्षित और कम आत्मीयता सीए 2 + संकेतकों का हूँ एस्टर रूप से कुशल फँसाने के लिए एक उच्च esterase गतिविधि प्रदान करता है.
लक्षित-esterase प्रेरित डाई लोड हो रहा है (टेड)
ईआर लुमेन को कम आत्मीयता सीए 2 + संकेतक के लक्ष्य में सुधार करने के लिए, टेड विकसित किया गया था. टेड अभिव्यक्ति निर्माणों के माध्यम से हासिल की है, जो एक ईआर लक्षित माउस carboxylesterase (CES2) (चित्रा 2), की overexpression की आवश्यकता है. एक पुनः संयोजक CES-निर्माण व्यक्त कोशिकाओं में कैल्शियम की हूँ एस्टर फार्म के साथ incubated हैंdicator डाई (Fluo5N-PM, चित्रा 2). फिर, ईआर में, डाई 2 सीए में बदल जाती है + संवेदनशील, झिल्ली अभेद्य 2 सीए इसलिए ईआर लुमेन 8 में एक उच्च एकाग्रता में डाई फँसाने उच्च esterase गतिविधि द्वारा + सूचक जटिल (Fluo5N/Ca 2), , 34. विधि SERCA 17 की नाकाबंदी के बाद उदाहरण के लिए सीधे "रिसाव चैनल" के माध्यम metabotropic, purinergic या ग्लूटामेट रिसेप्टर्स 8,34 के माध्यम से उदाहरण के लिए IiCR-रास्ते के माध्यम से ईआर कैल्शियम रिहाई की जांच करने के लिए और ईआर कैल्शियम कमी कल्पना करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है , 34. हमारे अनुभव करने के लिए कम आत्मीयता सीए 2 + सूचक Fluo5N-AM के वर्तमान टेड डाई लोड रणनीति के साथ उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा उपलब्ध सूचक है. Fluo5N-AM सीए 2 + के लिए एक कम संबंध है (हदबंदी निरंतर कश्मीर डी ~ 90 माइक्रोन, चित्रा 2), लगभग गैर फ्लोरोसेंट अपनी बजे से फार्म में है, लेकिन calciu पर उच्च प्रतिदीप्ति उत्सर्जन प्रदान करता हैमीटर बाध्यकारी 8,34. Fluo5N/Ca 2 जटिल ऐसे FITC, एलेक्सा 488, या EGFP के रूप में मानक रंगों से मेल खाती है ~ 490 एनएम का एक मानक प्रकाश स्रोत, के साथ उत्साहित किया जा सकता है. साइटोसोलिक कैल्शियम संकेतों शायद ही कम माइक्रोन रेंज में एक एकाग्रता तक पहुँचने और इसलिए मुश्किल से साइटोसॉल 35 में Fluo5N से पता चला रहे हैं.
टेड प्रदर्शन में सुधार करने के लिए, कई पुनः संयोजक वेक्टर निर्माणों (चित्रा 3) विकसित किए गए. मूलतः, CES2 की कोडिंग अनुक्रम (RefSeq परिग्रहण संख्या NM_145603, CES2c) और सर्वश्रेष्ठ टेड प्रदर्शन के आधार पर टेड वैक्टर CES के निर्माणों के स्थिर अभिव्यक्ति के साथ मनाया जाता है. नई टेड वैक्टर लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन TagRFP-टी 2 36 के लिए जुड़े हुए CES2 का मूल तत्व व्यक्त करते हैं. ये वैक्टर वे कोशिकाओं transduced की पहचान करने और Fluo5N/Ca 2 में परिवर्तन को सामान्य बनाने के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में लाल प्रतिदीप्ति का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि लाभ है + प्रतिदीप्ति. लाल प्रतिदीप्ति भी उत्तेजना परिस्थितियों में ईआर और ईआर गतिशीलता में परिवर्तन की संरचनात्मक वितरण कल्पना करने के लिए संभावना प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
टेड विधि के फायदे और नुकसान के हाल के प्रकाशनों 34,35 में बड़े पैमाने पर चर्चा की गई है. ऊपर वर्णित अन्य तरीकों की तुलना में, टेड कोशिकाओं में खलल न डालें और perfusing की समस्या circumvents. इसके अलावा, दो पहलुओं पर जो?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 और फ्रेडरिक Baur-Stiftung का अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है. हम टैग आरएफपी-टी 2 के साथ हमें प्रदान करने के लिए कैलिफोर्निया, सैन डिएगो के विश्वविद्यालय में रोजर वाई Tsien, हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट प्रयोगशालाओं को धन्यवाद देना चाहूंगा. हम शुक्र हमें lentiviral प्लास्मिडों FUGW उपलब्ध कराने, और psPAX2/pMD2.G के लिए डेविड बाल्टीमोर, कैलिफोर्निया प्रौद्योगिकी संस्थान, पासाडेना, और डिडिएर Trono, जिनेवा, जिनेवा, विश्वविद्यालय को स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| (S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine) | Tocris | 0805 | |
| 5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate | Sigma | A26209-1G | |
| B-27 supplement,50x | Invitrogen | 17504-044 | |
| Carbamoylcholine chloride (Charbachol) | Sigma | C4382-1g | |
| Cyclopiazonic acid (CPA) | Ascent scientific | Asc-300 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM with Glutamax | Invitrogen-Gibco | 31966-047 | |
| Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x | PAA | H15-002 | |
| Fetal calf serum | Invitrogen-Gibco | 10270-106 | |
| Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg | Invitrogen | F14204 | |
| Glutamate | Ascent scientific | Asc-049 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | |
| Ham’s F12 nutrients mixture | Invitrogen-Gibco | 21765-029 | |
| Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS | PAA Laboratories | H15-010 | |
| Horse serum | SHD3250YK | Linearis | |
| Ionomycin Ca2+ salt | Ascent scientific | Asc-116 | |
| murine EGF | PreproTech | 315-09 | |
| N2 supplement 100x | Invitrogen | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen-Gibco | 21103-049 | |
| Pluronic F127, low UV absorbance,2g | Invitrogen | P6867 | |
| Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN | Sigma | P8638 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma | P2636 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005-1mg | |
| TryLE Express | Invitrogen | 12605-028 | |
| Trypsin | Worthington | LS-003707 | |
| Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean) | Sigma | T6522 | |
| Materials | |||
| Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81 | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635) | Olympus | user-specific configuration | |
| Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector | Olympus | user-specific configuration | |
| Heater controller TC-344B | Warner Instruments | 64-0101 | to control in line solution heater |
| NIH ImageJ software | WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006 | ||
| Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35 | Olympus | N2709100 | |
| Objective: UPLFLN40XO | Olympus | N1478700 | |
| Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15 | Olympus | N1480700 | |
| Perfusion chamber, inverse | custom-made | ||
| Perfusion chamber, RC-49FS | Warner Instruments | W4 64-1709 | |
| Perfusion tube: PT-49 | Warner Instruments | 64-1730 | for perfusion |
| Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels) | Gilson | n.a. | perfusion pump |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | controlled by heater controller |
| Suction tubes: ST3R | Warner Instruments | 64-1407 | for perfusion |
| Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel | Pecon | n.a. |
Riferimenti
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