Direkte Imaging av ER Kalsium med målrettet-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Summary

Målrettet-esterase indusert dye lasting (TED) støtter analysen av intracellulære kalsium store dynamikken av fluorescens bildebehandling. Metoden baserer på målretting av en rekombinant karboksylesterase til endoplasmatiske retikulum (ER), hvor det forbedrer den lokale avsløring av syntetisk lav affinitet Ca^{2 +} Indikatoren fargestoffer i ER lumen.

Abstract

Visualisering av kalsium dynamikken er viktig å forstå hvilken rolle kalsium i cellen fysiologi. For å undersøke kalsium dynamikk, har syntetiske fluorescerende Ca ^{2 +} indikatorene blitt populært. Her har vi demonstrere TED (= målrettet esterase-indusert fargestoff lasting), en metode for å forbedre frigjøring av Ca ^{2 +-indikatoren} fargestoffer i ER lumen av forskjellige celletyper. Til dags dato ble benyttet i TED-cellelinjer, gliaceller, nerveceller og in vitro. TED baser på effektiv, rekombinant målretting av høy karboksylesterase aktivitet til ER lumen bruker vektor-konstruksjoner som uttrykker karboksylesterase (CES). De siste TED vektorer inneholder et kjerneelement i CES2 smeltet sammen til en rød fluorescerende protein, og dermed muliggjør samtidig to-farge bildebehandling. Dynamikken i fritt kalsium i ER er avbildes i én farge, mens tilsvarende ER struktur vises i rødt. Ved begynnelsen av prosessen, brukes-celler transdusert med en lentivirus. Deretter de infiserte celler enre sådd på Dekkglass å endelig gjøre det mulig live-cell imaging. Deretter blir levende celler inkubert med acetoksymetyl ester (AM-ester) form av lav affinitet Ca ^{2 +} indikatorer, for eksempel Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, eller Mag-Fura2-AM. Den esterase aktivitet i ER spalter off hydrofobe sidekjeder fra AM-formen av Ca ^{2 +-indikator} og en hydrofil fluorescerende fargestoff / Ca ^{2 +} kompleks dannes og fanget i ER lumen. Etter at fargestoff lasting, blir cellene analysert på en invertert konfokal laser scanning mikroskop. Celler er kontinuerlig perfused med Ringer-lignende løsninger og ER kalsium dynamikk er direkte visualisert ved time-lapse imaging. Kalsium frigjøring fra ER er identifisert ved en nedgang i fluorescens-intensitet i regioner av interesse, mens den påfylling av ER kalsium butikken gir en økning i fluorescensintensiteten. Til slutt, er endringen i fluorescerende intensitet over tid bestemmes ved beregning av A f / F _0.

Introduction

For å løse fysiologiske kalsium reaksjoner fra ER, har vi utviklet en ny strategi for å forbedre fangst av syntetiske kalsium sensitive fargestoffer inn i ER. Metoden gjør det mulig direkte, ikke-forstyrrende sanntids overvåking av fri ER kalsium i nærvær av ekstracellulært kalsium.

Funksjon og signalering av Akutten Kalsium

Kalsium signaler finnes i forskjellige celletyper, for eksempel muskel-celler, nevroner og gliaceller og deres funksjoner spenner fra formidling muskelkontraksjon til et engasjement i synaptiske transmisjon i læring og hukommelse ^1,2. Endringer i fritt kalsium konsentrasjonen er av høy vitenskapelig interesse fordi kalsium er involvert i reguleringen av gentranskripsjon, celleproliferasjon, neuronal oppstemthet, celledød og andre cellesignalisering hendelser ^1-7. Alle disse cellulære kalsium signalene er funksjonelt koblet til og bidra til intracellulær kalsiumbutikken dynamikk ^8-10.

Et felles trekk blant alle kalsium-signaler er flyten av kalsium mellom det ekstracellulære rom, cytosol og organeller, hovedsakelig ER og mitokondrier. Dette fører til dynamiske endringer i kalsium-konsentrasjon innenfor disse organeller, som er avfølt av forskjellige signalveier komponenter. Generelt, kalsium konsentrasjon på akuttmottaket varierer mellom 100-800 mikrometer, i cytosol kalsium konsentrasjonen er nær 100 nM, og i det ekstracellulære rom konsentrasjonen er rundt 1-2 mm. Følgelig er det en høy kjemisk drivkraft for kalsium flyter mot cytosol ^2,9,10.

De mest vanlig undersøkte ER-avledet kalsium signaler avhenger av stimuleringen av G-proteinkoblede reseptorer (GPCR), som deretter aktiverer fosfolipase C (PLC). PLC i sin tur produserer inositol 1,4,5-trisphosphate (IP ₃₎ ^1. Ved binding av IP ₃ til rec sineptor (IP _3-Rec, en figur) i ER-membranen, er kalsium ioner frigjøres fra ER lumen. Historisk sett var IP _3-mediert kalsium utgivelse fra ER først – selv om indirekte – målt i acinøse bukspyttkjertelen celler ved Streb et al i 1983 ^11.. Denne publikasjonen foreslått for første gang et signal kaskade involverer acetylkolin, fosfolipase C, og IP _3. Denne måten av kalsium utgivelsen er vanligvis betegnes IP _3-indusert kalsium utgivelse (IiCR) (Figur 1). Kinase-avhengig aktivering av fosfolipase Cγ av reseptor tyrosin kinaser lenker virkningen av vekstfaktorer og neurotrophic faktorer til ER kalsium signalisering etter IP ₃ høyde ^12. I tillegg til IiCR, kan kalsium høyde være mediert ved ionotrope kalsiuminngangen, for eksempel via spenningsstyrte kalsiumkanaler Ca _(V), og påfølgende kalsium-indusert kalsium-slipp (CICR) ved re ryanodineceptors (RyR). IiCR og CICR er fysiologisk knyttet til butikk-opererte kalsium oppføring (SOCE). SOCE inkluderer virkningen av STIM (stroma samspill molekylet), som er en sensor for ER kalsium utgivelse. Stim har vist seg å stimulere ekstracellulær kalsium posten gjennom transient receptor mulige kanaler (Trp), ¹³ Orai kalsiumkanaler ¹⁴ og til og med spenningsstyrte kalsiumkanaler ¹⁵ (figur 1). Tap av ER kalsium er dynamisk reddet av handlingen av Sarco-endoplasmic retikulum kalsium ATPase (SERCA), som aktivt pumper kalsium tilbake i ER. Blokkerer SERCA med rusmidler som thapsigargin avduker en kontinuerlig tap av ER kalsium til cytosolic kupé. Dette ER kalsium "lekkasjen" er forårsaket av ER intramembrane pore komplekser slik som Sec61 proteinkompleks ^16,17 (figur 1).

I 1998 publiserte Berridge en modell, "nervecellen innenfor et nevron modell", hh antyder et prinsipp fysiologisk rolle ER i å integrere neuronal kalsium ^fem. Denne modellen betrakter eksistensen av en kontinuerlig ER membransystem danner en intracellulær "bilde" av den neuronale plasmamembranen ^5.. Dette binære eukaryote membran system ble hevdet å være en grunnleggende forutsetning for temporal og romlig integrasjon av raske og langsomme kalsium signaler i nerveceller. Kalsium signaler som oppstår enten samtidig eller senere i forskjellige pigger eller dendritter av samme nervecellen er overdratt til cellens soma eller kjernen via akuttmottaket, hvor de blir summert opp ^5,18. Deretter kan deres sum ha effekter på excitability av nervecellen, regulering av gentranskripsjon eller integrering av signalering kaskader. Således støtter ER integrering av kalsium-signaler. En forutsetning for dette konseptet er at kontinuiteten av ER i en enkelt celle, som er blitt krevd av flere studier, og som har vist seg i det minste for somato-dendritic områder og kort avstand aksonale anslag ^19-21. Enten det er ER kontinuitet i lange aksonale anslag er et spørsmål om debatt.

Strategier for å måle strømmen av fritt kalsium over ER membranen

Kalsium signaler er oftest overvåket i cytosol ^22,23. Derfor kan det ikke lett kan identifiseres enten Ca ^{2 +} strømmer inn i cytosol fra ekstracellulære eller intracellulære fra butikker ^6,24. For å overkomme denne begrensningen, har metodiske strategier for direkte ER kalsium bildebehandling blitt utviklet. Oppsummert er følgende strategier brukt: (1) ER-målrettet genmodifisert protein-indikatorer ^25-27 Protein-baserte lav affinitet Ca ^{2 +} indikatorer bruke selvlysende protein aequorin eller GFP i kombinasjon med en kalsium sensing protein.. Disse genmanipulerte Ca ^{2 +} indikatorer (GECIs) kanvære rettet til ER ved hjelp av en signal peptid og er aktivt holdt i ER ved hjelp av en retensjon og gjenfinning motiv. Felles ER Ca ^{2 +} indikatorer base på Cameleon prinsippet og er Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon split YC7.3ER ^29, og Cameleon D1 ^30. (2) Direkte esterase-basert dye lasting av AM-ester lav affinitet Ca ^{2 +} indikatorer ^31,32. AM-derivater av indikatoren fargestoffer (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM eller Fluo5N-AM) passere biologiske membraner i en lipofile, kalsium-ufølsom tilstand. Deretter, i cytosol, så vel som i ER, endogene esteraser spalter av AM-estergruppen og slipper Ca ^{2 +} indikator, etterlater en viss mengde aktivt fargestoff i cytosol og i ER. Derfor er denne tilnærmingen nyttig under betingelser med en høy kalsiumkonsentrasjon i ER så lenge cytosolisk kalsium-konsentrasjonen forblir godt under debeskyttelse grensen for lav affinitet indikatorer, særlig i karakteristiske kalsium signaler (f.eks nM til lave mikrometer). (3) AM-ester lasting i kombinasjon med plasmamembranen permeabilization ^32.. Enhver gjenværende cytosoliske Ca ^{2 +} Indikatoren fjernes ved plasmamembranen permeabilization med små mengder av en "mild" vaskemiddel (f.eks saponin) i en kunstig intracellulær buffer. Således kan de intracellulære membraner bli stimulert, for eksempel med IP ₃ i den intracellulære buffer, direkte gjennom "porer" i plasmamembranen. (4) Dialyse av cytosol 'under hel-celle-konfigurasjon og samtidige målinger av Ca ^{2 +} i ER lumen og cytosol ^32,33. En celle først lastes med en lav-affinitets Ca ^{2 +-indikator} (f.eks Mag-Fura2- AM, proporsjonal, UV-lys). Etterpå, med hjelp av en patch pipette, eventuelle gjenværende cytosolic lav-affinitets Ca ^{2 +} indikator dialyseres ut av cytosol med en buffer som inneholder et høy-affinitets Ca ^{2 +-indikator} (f.eks Fluo-3, synlig lys). Denne strategien gjør det samtidig opptak av cytosolic og ER avledet signaler. (5) Målrettet-esterase-indusert dye lasting ^8,34. En karboksylesterase (CES) er rettet til lumen av ER og gir en høy esterase aktivitet for effektiv fangst av AM-ester form av lav-affinitet Ca ^{2 +} indikatorer.

Målrettet-esterase indusert dye lasting (TED)

For å bedre målretting av lav affinitet Ca ^{2 +} indikatorer til ER lumen, ble TED utviklet. TED krever overuttrykte en ER målrettet mus karboksylesterase (CES2) (figur 2), som oppnås via ekspresjonskonstruksjoner. Celler som uttrykker et rekombinant CES-konstruktet blir inkubert med AM-esterform av et kalsium idikator fargestoff (Fluo5N-AM, figur 2). Deretter, i ER, er fargestoffet omdannet til ^{Ca2 +} sensitiv, ugjennomtrengelig membran Ca ^{2 +} indikator kompleks (Fluo5N/Ca ^{2 +)} med høy esterase aktivitet, derfor overlapping fargestoffet i en høy konsentrasjon i ER lumen ^{8 , 34.} Metoden er spesielt nyttig å undersøke ER kalsium-release via IiCR-trasé for eksempel via metabotrope, purinergiske-eller glutamat reseptorer ^8,34 og visualisere ER kalsium uttømming via "lekkasje kanaler" direkte, for eksempel etter blokade av SERCA ^{17 , 34.} Til vår erfaring med lav affinitet Ca ^{2 +} indikator Fluo5N-AM er i dag den beste tilgjengelige indikatoren for å bruke med TED fargestoff lasting strategi. Fluo5N-AM har lav affinitet for Ca ^{2 +} (dissosiasjonskonstant K _D ~ 90 mikrometer, figur 2), er nesten ikke-fluoriserende i sin AM-form, men gir høy fluorescensemisjon på Calcium binding ^8,34. Den Fluo5N/Ca ^{2 +} kompleks kan bli eksitert med en standard-lyskilde på ~ 490 nm, som tilsvarer vanlige fargestoffer slik som FITC, 488 Alexa, eller eGFP. Cytosolisk kalsium signaler neppe oppnå en konsentrasjon i det lave uM området og blir derfor knapt påvises ved Fluo5N i cytosol ^35..

For å forbedre TED ytelse, ble flere rekombinante vektor konstruksjoner utviklet (figur 3). Opprinnelig er TED vektorer basert på koding sekvensen av CES2 (Refseq tiltredelse nummer NM_145603, CES2c) og beste TED ytelse observert med stabil uttrykk for CES konstruksjoner. Nye TED vektorer uttrykke et kjerneelement i CES2 smeltet til rød fluorescens protein TagRFP-T2 ^36. Disse vektorene har den fordelen at de kan brukes til å identifisere transduserte celler og å bruke den røde fluorescens som en intern kontroll for normalisering av endringer i Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescens. Den røde fluorescens tilbyr også muligheten for å visualisere det strukturelle fordeling av ER og endringer i ER dynamikk henhold stimulering forhold.

Protocol

Denne protokollen introduserer TED brukes på cellelinjer, hippocampus nevroner og kortikale gliaceller. TED ytelsen er best når TED vektorer er stabilt uttrykt, for eksempel ved lentiviral vektorer. En skjematisk oversikt over TED-metoden er vist i figur 4.. En. Utarbeidelse av løsninger Følgende løsninger bør være forberedt før du starter og kan lagres som angitt. Vi bruker vanligvis steriliserte glass og plastmateriale og autoklavert vann…

Representative Results

Denne protokollen gir en ikke-forstyrrende tilnærming for direkte avbildning av gratis ER kalsium. Lav-affinitets syntetisk Ca 2 + indikatorer frigjøres og fanget i ER lumen ved hjelp av en ER målrettet, rekombinant esterase enzymaktivitet. Forbedret lasting av Ca 2 + indikatoren fargestoffer til ER lumen gjør en direkte og rask avbildning av ER kalsium butikken dynamikk. Celletyper for TED Gjennomførbarheten av metoden har blitt vist i ce…

Discussion

Fordelene og ulempene ved TED metoden har vært diskutert mye i nyere publikasjoner ^34,35. Sammenlignet med andre fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor, omgår TED problemet med å forstyrre og perfusing cellene. Videre to aspekter må vektlegges. Prinsippet for TED for ER kalsium avbildning krever (1). Den målrettede ekspresjon av et aktivt karboksylesterase i ER lumen ved hjelp av TED vektor konstruksjoner og (2). Den effektive og preferensiell frigjøring av lav-affinitet syntetiske AM-esterne kalsium …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham’s F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
			Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.