Direct Imaging de calcio ER con Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED)

Summary

Targeted-esterasa inducida colorante de carga (TED) es compatible con el análisis de la dinámica del almacén de calcio intracelular por imágenes de fluorescencia. El método basa en la orientación de un carboxilesterasa recombinante para el retículo endoplásmico (ER), donde mejora el desenmascaramiento local del sintético de baja afinidad Ca^{2 +} Tintes indicadores en el lumen del RE.

Abstract

Visualización de la dinámica de calcio es importante para entender el papel del calcio en la fisiología celular. Para examinar la dinámica del calcio, fluorescentes Ca ^{2 +} indicadores sintéticos se han vuelto populares. Aquí demostramos TED (= carga de colorante inducida dirigido-esterasa), un método para mejorar la liberación de Ca ^{2 +} colorantes indicadores en el lumen del retículo endoplasmático de diferentes tipos de células. Hasta la fecha, el TED se utilizó en líneas celulares, células gliales y neuronas in vitro. Bases TED en eficiencia, recombinante orientación de una actividad de alto carboxilesterasa al lumen ER usando vectores construcciones que carboxilesterasas expresos (CES). Los últimos vectores TED contienen un elemento central de CES2 fusionado a una proteína fluorescente de color rojo, lo que permite simultánea de imágenes de dos colores. La dinámica de calcio libre en el ER se obtuvieron imágenes en un solo color, mientras que la estructura ER correspondiente aparece en rojo. Al comienzo del procedimiento, las células son transducidas con un lentivirus. Posteriormente, las células infectadas unare sembraron en cubreobjetos para finalmente permitir imágenes de células vivas. Entonces, las células vivas se incuban con el éster de acetoximetilo (AM-éster) de forma de baja afinidad Ca ^{2 +} indicadores, por ejemplo Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, o Mag-Fura2-AM. La actividad esterasa en los unirá ER frente cadenas laterales hidrófobas de la forma de AM de la Ca ^{2 +} indicador y un colorante fluorescente / Ca ^{2 +} complejo hidrófilo se forma y atrapado en el lumen del RE. Después de colorante de carga, las células se analizaron en un microscopio de barrido láser confocal invertido. Las células se sometieron a perfusión continua con soluciones de Ringer-como y la dinámica del calcio ER son directamente visualizada por time-lapse. La liberación de calcio desde el RE se identifica por una disminución en la intensidad de fluorescencia en las regiones de interés, mientras que la recarga de la tienda de calcio ER produce un aumento en la intensidad de fluorescencia. Por último, el cambio en la intensidad de fluorescencia con el tiempo se determina mediante el cálculo de Delta F / F _0.

Introduction

Con el fin de resolver las respuestas fisiológicas del calcio ER, hemos desarrollado una nueva estrategia para mejorar la captura de tintes sensibles calcio sintéticos en la sala de emergencias. El método permite la monitorización en tiempo real, directa, sin interrupciones del libre ER calcio en presencia de calcio extracelular.

Función y señalización de calcio ER

Señales de calcio se encuentran en diferentes tipos de células, por ejemplo células de músculo, neuronas y células gliales y su gama de funciones de la mediación de la contracción del músculo a una participación en la transmisión sináptica en el aprendizaje y la memoria ^1,2. Los cambios en la concentración de calcio libre son de alto interés científico porque el calcio está implicado en la regulación de la transcripción de genes, la proliferación celular, la excitabilidad neuronal, muerte celular y otros eventos de señalización celular ^1-7. Todas estas señales de calcio celulares están funcionalmente conectados y contribuyen a intracelular de calciotienda ^8-10 dinámica.

Una característica común entre todas las señales de calcio es el flujo de calcio entre el espacio extracelular, el citosol y los orgánulos, principalmente la sala de emergencia y las mitocondrias. Esto hace que los cambios dinámicos en la concentración de calcio dentro de estos orgánulos, los cuales son percibidos por los diferentes componentes de señalización. En general, la concentración de calcio en los rangos de ER entre 100 a 800 mM, en el citosol de la concentración de calcio es cerca de 100 nM, y en el espacio extracelular, la concentración es de alrededor de 1-2 mM. En consecuencia, hay una fuerza motriz química alta para el flujo de calcio hacia el citosol ^2,9,10.

Las señales de calcio derivados del ER más comúnmente investigados dependen de la estimulación de receptores acoplados a proteína G (GPCR), que a continuación, activan la fosfolipasa C (PLC). PLC a su vez produce inositol 1,4,5-trifosfato (IP ₃₎ ^1. Tras la unión de _IP3 a su receptor _(IP-3 Rec., Figura 1) en el ER-membrana, los iones de calcio son liberados desde el lumen del retículo endoplasmático. Históricamente, la liberación de calcio mediada por IP ₃ de la ER fue el primero – aunque indirectamente – medido en células pancreáticas acinares por Streb et al en 1983 ^11.. Esta publicación sugirió por primera vez una cascada de señalización que implica la acetilcolina, la fosfolipasa C, y IP _3. Esta forma de liberación de calcio se denomina generalmente la liberación de calcio inducida por _3-IP (TIIE) (Figura 1). La activación de la quinasa dependiente de fosfolipasa Cγ por receptores tirosina quinasas vincula la acción de factores de crecimiento y factores neurotróficos para ER señalización de calcio después de _IP3 elevación ^12. Además de TIIE, elevación de calcio puede ser mediada por la entrada de calcio ionotrópicos, por ejemplo a través de los canales de calcio dependientes de voltaje (CA _V), y la posterior liberación de calcio inducida por calcio (CICR) por rianodina receptores (RyR). TIIE y el CICR están fisiológicamente vinculados a la entrada de calcio tienda que funciona (SOCE). SOCE incluye la acción de STIM (molécula interactuante estroma), que es un sensor para la liberación de calcio ER. STIM se ha demostrado que estimula la entrada de calcio extracelular a través de canales receptores de potencial transitorio (TRP) ^13, Orai canales de calcio y hasta ¹⁴ canales de calcio dependientes del voltaje ¹⁵ (Figura 1). La pérdida de calcio ER es rescatado dinámicamente por la acción del retículo endoplásmico sarco-ATPasa de calcio (SERCA), que activa las bombas de calcio de nuevo en la sala de emergencias. El bloqueo de la SERCA con fármacos tales como tapsigargina presenta una pérdida continua de calcio ER para el compartimiento citosólico. Esta ER calcio "fuga" es causado por ER complejos de poro intramembrane tales como el complejo de proteína Sec61 ^16,17 (Figura 1).

En 1998, Berridge publicó un modelo, la "neurona dentro de un modelo de neurona", which sugiere un papel fisiológico principio de la ER en la integración de calcio neuronal ^5. Este modelo considera la existencia de un sistema de membrana del RE continua que forma una "imagen" intracelular de la membrana plasmática neuronal ^5. Este sistema de membranas eucariotas binario se afirma que es un requisito básico para la integración temporal y espacial de las señales de calcio rápidos y lentos en las neuronas. Señales de calcio que se producen ya sea concomitantemente o posteriormente en diferentes espinas o dendritas de la misma neurona se confieren al soma o núcleo a través de la sala de emergencias, en el que se resumen ^5,18 de la célula. Entonces, su suma puede tener efectos sobre la excitabilidad de la neurona, la regulación de la transcripción de genes o la integración de cascadas de señalización. Por lo tanto, la sala de emergencias apoya la integración de las señales de calcio. Un requisito previo para este concepto es la continuidad de la ER en una sola célula, que ha sido reclamada por varios estudios y que se ha demostrado al menos para somato-dáreas endritic y corta distancia proyecciones axonales ^19-21. Si hay continuidad ER dentro de proyecciones axonales largas es una cuestión de debate.

Estrategias para medir el flujo de calcio libre sobre la membrana ER

Señales de calcio se controlan con mayor frecuencia en el citosol ^22,23. Por lo tanto, no puede ser distinguido fácilmente si Ca ^{2 +} está fluyendo hacia el citosol a partir extracelular o intracelular de las tiendas ^6,24. Para superar esta limitación, se han desarrollado estrategias metodológicas para la obtención de imágenes directas de calcio ER. En resumen, se utilizan las siguientes estrategias: (1) ER-dirigidos ingeniería genética de proteínas indicadores ^25-27 de baja afinidad Ca ^{2 +} indicadores basados ​​en la proteína utilizan la proteína aequorina bioluminiscente o GFP en combinación con una proteína de detección. Calcio. Estos Ca ^{2 +} indicadores de ingeniería genética (Gecis) puedeser dirigidos a la sala de emergencia con la ayuda de un péptido señal y se mantienen activamente en el ER mediante un motivo de retención y recuperación. Común ER Ca ^{2 +} indicadores de base en el principio de Cameleon y son el Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon división YC7.3ER ²⁹ y Cameleon D1 ^30. (2) Directo carga de colorante a base de esterasa AM-éster de baja afinidad Ca ^{2 +} indicadores. ^31,32 de los colorantes indicadores (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM o Fluo5N-AM)-derivados AM pasar el membranas biológicas en un estado lipofílica, calcio y minúsculas. Entonces, en el citosol, así como en la sala de emergencias, esterasas endógenas escindir el grupo de AM-éster y liberan el indicador de Ca ^{2 +,} dejando tras de sí una cierta cantidad de colorante activo en el citosol y en la sala de emergencias. Por lo tanto, este enfoque es útil en condiciones de una alta concentración de calcio en la sala de emergencias, siempre y cuando la concentración de calcio citosólico se mantiene muy por debajo de la delímite de protección de los indicadores de baja afinidad, en particular durante las señales de calcio características (por ejemplo nM a mM bajas). (3) de carga AM-éster en combinación con permeabilización de la membrana plasmática ^32. Cualquier ⁺ indicador restante citosólica de Ca ² se elimina mediante permeabilización de la membrana de plasma con pequeñas cantidades de un detergente "suave" (por ejemplo, saponina) en un tampón intracelular artificial. Por lo tanto, las membranas intracelulares pueden ser estimuladas, por ejemplo, con IP ₃ en el tampón intracelular, directamente a través de "poros" en la membrana plasmática. (4) Diálisis del citosol bajo configuración de célula y las mediciones simultáneas de Ca ^{2 +} en el lumen del RE y el citosol ^32,33. Una celda se carga por primera vez con una baja afinidad Ca ^{2 +} indicador (por ejemplo, Mag-Fura2- AM, radiométrico, la luz ultravioleta). Después, con la ayuda de una pipeta de parche, cualquier cyt restanteCa ⁺ Indicador de baja afinidad ² osolic se dializa fuera del citosol con un tampón que contiene un indicador de Ca ^{2 +} de alta afinidad (por ejemplo, Fluo-3, la luz visible). Esta estrategia permite la grabación simultánea de señales derivadas citosólicas y ER. (5) Targeted-esterasa inducida colorante de carga ^8,34. Un carboxilesterasa (CES) se dirige al lumen del ER y proporciona una alta actividad de esterasa para la captura eficiente de la forma de AM-éster de baja afinidad Ca ^{2 +} indicadores.

Inducida Targeted-esterasa colorante de carga (TED)

Para mejorar la focalización de baja afinidad Ca ^{2 +} indicadores a la luz del RE, TED se ha desarrollado. TED requiere la sobreexpresión de una carboxilesterasa ER dirigido ratón (CES2) (Figura 2), que se consigue a través de construcciones de expresión. Las células que expresan un CES-constructo recombinante se incuban con la forma de AM-éster de un calcio enindicador colorante (Fluo5N-AM, la Figura 2). A continuación, en la sala de emergencias, el colorante se convierte en el Ca ^{2 +} sensibles, membrana impermeable Ca ^{2 +} complejo indicador (Fluo5N/Ca ^{2 +)} por la alta actividad de esterasa, por lo tanto atrapando el colorante en una alta concentración en el lumen del RE ^{8 , 34.} El método es especialmente útil para investigar-ER liberación de calcio a través de las vías de TIIE-por ejemplo a través de metabotrópicos purinérgicos-o receptores de glutamato, ^8,34 y para visualizar el agotamiento de calcio ER a través de "canales de fugas" directamente, por ejemplo, después del bloqueo de la SERCA ^{17 , 34.} Para nuestra experiencia, la baja afinidad de Ca ^{2 +} indicador Fluo5N-AM es actualmente el mejor indicador disponible para su uso con la estrategia de carga TED tinte. Fluo5N-AM tiene una baja afinidad por Ca ^{2 +} (constante de disociación K _D ~ 90 mM, Figura 2), es casi no fluorescente en su AM-forma, pero ofrece una alta emisión de fluorescencia a calciu^8,34 m vinculante. El Fluo5N/Ca ^{2 +} complejo puede ser excitado con una fuente de luz estándar de ~ 490 nm, que corresponde a los tintes estándar tales como FITC, Alexa 488, o eGFP. Señales de calcio citosólico apenas alcanzan una concentración en el rango de baja mu M y por lo tanto apenas se detectaron por Fluo5N en el citosol ^35.

Para mejorar el funcionamiento del TED, se han desarrollado varias construcciones de vectores recombinantes (Figura 3). Originalmente, los vectores de TED basado en la secuencia de codificación de CES2 (Refseq número de acceso NM_145603, CES2c) y mejor funcionamiento del TED se observa con expresión estable de construcciones de CES. Nuevos vectores TED expresan un elemento central de CES2 fusionado a la proteína roja fluorescente TagRFP-T2 ^36. Estos vectores tienen la ventaja de que pueden ser utilizados para identificar las células transducidas y para utilizar la fluorescencia roja como un control interno para la normalización de los cambios en Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescencia. La fluorescencia de color rojo también ofrece la posibilidad de visualizar la distribución estructural de la sala de emergencia y los cambios en la dinámica de ER en condiciones de estimulación.

Protocol

Este protocolo introduce TED aplica a líneas de células, neuronas del hipocampo y células gliales corticales. TED rendimiento es mejor cuando los vectores TED se expresa de forma estable, por ejemplo por medio de vectores lentivirales. Una visión general esquemática del método de TED se muestra en la Figura 4. 1. Preparación de las soluciones Las siguientes soluciones deben estar preparados antes de comenzar y pueden ser almacenados como se …

Representative Results

Este protocolo proporciona un enfoque no-perjudicial para la imagen directa de la libre ER calcio. De baja afinidad sintética Ca 2 + indicadores son liberados y atrapados en el lumen del RE con la ayuda de un ER específica, actividad de la enzima esterasa recombinante. Mejora de la carga de la Ca 2 + indicador tintes para el ER lumen permite una imagen directa y rápida de la dinámica de la tienda calcio ER. Tipos de células de TED La viabi…

Discussion

Las ventajas y desventajas del método TED se han discutido ampliamente en publicaciones recientes ^34,35. En comparación con otros métodos descritos anteriormente, el TED evita el problema de la interrupción y la perfusión de las células. Por otra parte, dos aspectos deben ser enfatizado. El principio de TED para ER imágenes de calcio requiere de (1.) La expresión selectiva de una carboxilesterasa activo en el lumen del retículo endoplasmático con la ayuda de TED constructos vectoriales y (2.) La lib…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5′;-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco’s PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham’s F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank’s BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
			Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997–2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.