Dreidimensionale Bildgebung Nozizeptive Intraepidermale Nervenfasern im menschlichen Hautproben
Summary
Um die Änderungen des nozizeptiven intraepidermal Nervenfasern (IENFs) in schmerzhafte Neuropathie (PN) zu untersuchen, haben wir Protokolle, die direkt untersuchen könnte dreidimensionalen morphologischen Veränderungen in nozizeptiven IENFs beobachtet. Dreidimensionale Analyse IENFs hat das Potenzial, um die morphologischen Veränderungen in IENF PN bewerten.
Abstract
Ein Schlag Biopsie der Haut wird üblicherweise zur intraepidermal Nervenfaser Dichten (IENFD) für die Diagnose der periphere Polyneuropathie 1,2 quantifizieren. Derzeit ist es üblich, 3 mm Hautproben von dem distalen Schenkel (DL) und dem proximalen Schenkel (PT) für die Bewertung der längenabhängigen Polyneuropathien 3 sammeln. Aufgrund der multidirektionalen Art IENFs, ist es schwierig zu prüfen überlappenden Nervenstrukturen durch die Analyse von zweidimensionalen (2D-) Bildgebung. Alternativ könnte dreidimensionale (3D)-Bildgebung eine bessere Lösung für dieses Dilemma.
Im vorliegenden Bericht stellen wir Methoden für die Anwendung 3D-Bildgebung zu schmerzhaften Neuropathie (PN) zu studieren. Um IENFs zu identifizieren, werden Hautproben für Immunfluoreszenz-Analyse von Protein-Genprodukt 9.5 (PGP), ein pan-neuronalen Marker verarbeitet. Derzeit ist es üblich, kleine Faser Neuropathie mit IENFD abschrecken diagnostizierenabgebaut durch PGP Immunhistochemie mit Hellfeldmikroskopie 4. In der aktuellen Studie, angewendet wir doppelte Immunfluoreszenz Analyse insgesamt IENFD identifizieren, die mit PGP und nozizeptiven IENF, durch den Einsatz von Antikörpern, die Tropomyosin-Rezeptor-Kinase erkennen A (Trk A), die hohe Affinität Rezeptor für nerve growth factor 5. Die Vorteile der Co-Färbung IENF mit PGP und Trk A-Antikörper profitiert die Studie von PN deutlich Färbung PGP-positive, nozizeptiven Fasern. Diese fluoreszierenden Signale quantifiziert nozizeptiven IENFD und morphologische Veränderungen von IENF mit PN assoziiert zu bestimmen. Die Fluoreszenzbilder werden durch konfokale Mikroskopie erfasst und verarbeitet, für die 3D-Analyse. 3D-Bildgebung liefert Dreh-Fähigkeiten weiter zu analysieren morphologische Veränderungen mit PN verbunden. Zusammengenommen fluoreszierenden Co-Färbung, konfokale Bildgebung und 3D-Analyse eindeutig profitieren die Studie von PN.
Introduction
Derzeit ist es üblich, für Ärzte, intraepidermalen Nervenfaser Dichten (IENFD) von der Haut Stanzbiopsien, die verwendet werden, um kleine Faser Neuropathie 3, 6-8 diagnostizieren kann quantifizieren. Biopsien aus dem distalen Schenkel (DL), 10 cm über den Malleolus lateralis und den proximalen Schenkel (PT), 20 cm unterhalb der Spina iliaca anterior 9. Alle IENF sind beschriftet mit Protein-Genprodukt 9.5 (PGP), ein pan-neuronalen Marker 10-12. Derzeit ist es üblich, kleine Faser mit Neuropathien diagnostizieren IENFD bestimmt durch Färbung mit PGP Hellfeldmikroskopie 6. Darüber hinaus haben mehrere Arbeitsgruppen Immunfluoreszenz Protokolle für PGP Immunhistochemie 7-9 verwendet. Kleine Faser Neuropathie ist häufig mit neuropathischen Schmerzen verbunden. Zur weiteren Verständnis der Rolle von IENF wichtig für Schmerzen Verarbeitung, entwickelten wir eine Technik, um Co-Label insgesamt IENF mit Fasern, die Schmerzen zu erzeugen. Nozizeptorentive IENF, speziell A &dgr; und C-Fasern, durch die Co-Kennzeichnung IENF mit PGP und des nozizeptiven Marker, Tropomyosin-Rezeptor-Kinase A (Trk A) 5 untersucht werden. Trk A ist der Rezeptor mit hoher Affinität für NGF, die für die Entwicklung der Nozizeption ist. Die Trk A-positive nozizeptiven Nervenfasern sind peptiderge Fasern, express Substanz P (SP) und Calcitonin Gene Related Peptide (CGRP). Zuvor angewendet Lauria und Kollegen der doppelten Kennzeichnung Technik PN, Co-Kennzeichnung PGP-positive IENF mit einer nozizeptiven Markierung 10 zu studieren. In unserer früheren Studie haben wir gezeigt, dass Trk A-positive IENF, aber nicht Trk A-negative IENF, in einem Tiermodell der schmerzhaften diabetischen Neuropathie 5 wurden hochreguliert. Diese Co-Kennzeichnung Technik bietet die Möglichkeit, die Quantifizierung von nozizeptiven IENFD vergleichen, um IENFD und die Fähigkeit zur morphologischen Veränderungen mit PN zugeordnet studieren insgesamt. Die Fähigkeit, nozizeptiven IENF und Unternehmen visualisierenre Quantifizierung der gesamten IENFD zu nozizeptiven IENFD könnte Ziel Beweis für das Vorhandensein von Schmerz und möglicherweise Einblick in die Schwere der Schmerzen mit PN assoziiert ist. Diese Technik ist auch auf die Haut von Tiermodellen. Im Vergleich zu früheren Studien, beschreibt das aktuelle Protokoll Methoden zur 3D-Bildanalyse, die Schaffung der Möglichkeit, Fehler, die in 2D Bildanalyse auftreten könnten, zu vermeiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Messung der IENFD wurde weithin verwendet, um den Grad von peripheren Neuropathien 13,14 bestimmen. Derzeit ist die am häufigsten verwendete Protokoll misst nur die Dichten von Nervenfasern, die die Basalmembran der Epidermis eindringen, es nicht zu berücksichtigen axonale Verzweigung und / oder morphologische Veränderungen der Nerven. Darüber hinaus hat IENFD aktuellen Analyse nicht gezeigt worden, um mit dem Vorhandensein von Schmerzen in PN 15 IENFD korrelieren.
…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health unterstützt Grants K08 NS061039-01A2, das Programm für Neurologie Research & Discovery, and The A. Alfred Taubman Medical Research Institute an der University of Michigan. Diese Arbeit verwendet die Morphologie und Bildanalyse Kern der Michigan Diabetes Research and Training Center, National Institutes of Health Grants 5P90 DK-20572 aus dem National Institute of Diabetes and Digestive und Nierenkrankheiten finanziert. Die Autoren bedanken sich bei Robinson Singleton und Gordon Smith (University of Utah) für die großzügige Spende von menschlichen Hautproben, die anfängliche Entwicklung des nozizeptiven Biomarker Immunhistochemie Technik unterstützt danken.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | To make up 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal rabbit) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosin Related-Kinase A (Polyclonal goat) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 donkey α-rabbit | Invitrogen | A21206 | AF488 donkey α-goat |
| Alexa Fluor 647 donkey α-goat | Invitrogen | A21447 | AF647 donkey α-goat |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Non-calibrated Loop | LeLoop | MP 199025 | inoculating Loop |
| 96-well assay plate | Corning Incorporated | 3603 | Well plate |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscope Cover Glass 22×22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Coverslips |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscope Slides |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV500 | Confocal Microscope |
| Optimum Cutting Temperature | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
Riferimenti
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