TruTip एक झरझरा, अखंड बंधन मैट्रिक्स एक विंदुक टिप में डाला जाता है जिससे एक सरल न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रौद्योगिकी है. नतीजतन, नमूना तैयार प्रारूप सबसे अधिक तरल से निपटने के साधन के साथ संगत है, और उच्च throughput नैदानिक अनुप्रयोगों और नमूना प्रकार के लिए कई माध्यम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
TruTip एक झरझरा, अखंड बंधन मैट्रिक्स एक विंदुक टिप में डाला जाता है जिससे एक सरल न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रौद्योगिकी है. केवल पत्थर का खंभा की ज्यामिति 1.0 से 5.0 मिलीग्राम की मात्रा में लेकर विशिष्ट पिपेट सुझाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. केवल पत्थर का खंभा के बड़े सरंध्रता आसानी न्यूनतम fluidic backpressure साथ के माध्यम से इसे पारित करने के लिए चिपचिपा या जटिल नमूने लिए सक्षम बनाता है. द्विशताब्दी दिशात्मक प्रवाह केवल पत्थर का खंभा और नमूना के बीच निवास समय अधिकतम हो पाता है, और एक भी TruTip भीतर संसाधित करने के लिए बड़ा नमूना संस्करणों में सक्षम बनाता है. चाहे नमूना मात्रा या TruTip ज्यामिति के मौलिक कदम,, सेल, TruTip केवल पत्थर का खंभा के भीतर pores के लिए बाध्य न्यूक्लिक एसिड, अबाध नमूना घटकों और सेल बफ़र्स दूर धोने, और एक उचित बफर में शुद्ध और केंद्रित न्यूक्लिक एसिड eluting शामिल हैं. TruTip की विशेषताओं और अनुकूलन क्षमता एक Eppendorf epMotion 5070 का उपयोग कर तीन स्वचालित नैदानिक नमूना प्रसंस्करण प्रोटोकॉल में प्रदर्शन कर रहे हैं, हैमिल्टन स्टार और nasopharyngeal aspirate, पूरे रक्त से जीनोमिक डीएनए अलगाव, और भ्रूण डीएनए निष्कर्षण और मातृ प्लाज्मा की बड़ी मात्रा में (क्रमशः) से संवर्धन से शाही सेना अलगाव सहित STARplus तरल से निपटने रोबोट,.
न्यूक्लिक एसिड शुद्धि सबसे आणविक निदान के लिए, अनुसंधान केवल उपयोग आवश्यक है, और जीवन विज्ञान अनुप्रयोगों. विभिन्न दृष्टिकोण क्लोरोफॉर्म / फिनोल एक्सट्रेक्शन के समय के बाद उभरा है, जिनमें से कई chaotropic लवण 1 की उपस्थिति में सिलिका के लिए बाध्य न्यूक्लिक एसिड के मौलिक सिद्धांत पर आधारित हैं. निष्कर्षण प्रक्रिया (2-13 में उदाहरण देखें) स्पिन फिल्टर, चुंबकीय मोतियों और जीवन विज्ञान उद्योग हावी संबंधी दृष्टिकोण के साथ, विभिन्न मनका और झिल्ली आधारित स्वरूप के उपयोग के माध्यम से सुव्यवस्थित और स्वचालित कर दिया गया है. प्रभावी जबकि चुनौतीपूर्ण नैदानिक matrices के साथ सामना किया, कण और झिल्ली सीमाओं को जानते हैं. उदाहरण के लिए, झिल्ली और मनका के आधार स्तंभों शिकायत कर रहे हैं, छोटे आकार ताकना (इस प्रकार, उच्च वापस दबाव) है, और एक अपकेंद्रित्र या वैक्यूम सिस्टम से संसाधित करने के क्रम में समर्थन के कुछ प्रकार की आवश्यकता होती है. झिल्ली की शारीरिक विशेषताओं और मनका कॉलम परिणाम मेंकुशलतापूर्वक उपभोज्य, और / या ऊनि दिशात्मक प्रवाह पथ के माध्यम से संसाधित किया जा सकता है कि कुल (इनपुट) नमूना मात्रा clogging बिना कार्रवाई की जा सकती है कि नमूने के प्रकार सीमा है, जो महत्वपूर्ण fluidic प्रतिरोध,. इसके विपरीत, चुंबकीय कणों आंदोलन से नमूना भर में वितरित किया जाना चाहिए. homogenously एक समाधान के भीतर चुंबकीय कणों वितरित करने की आवश्यकता सबसे अधिक चुंबकीय मनका उपभोग्य साथ संसाधित किया जा सकता है कि कुल इनपुट नमूना मात्रा को सीमित करता है. क्लीनिकल नमूना विशेषताओं (जैसे चिपचिपाहट या जटिलता के रूप में) एक ट्यूब या छड़ के पक्ष में अक्षम चुंबकीय कण एकाग्रता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, सिलिका ठीक कण उनके आकर्षण संस्कार खोने और अंतिम नमूना contaminating, निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान मोती के बंद को तोड़ सकते हैं.
TruTip प्रौद्योगिकी इन न्यूक्लिक एसिड नमूना प्रसंस्करण बाधाओं और सीमाओं के 14 में से कुछ को दूर करने के लिए विकसित किया गया था. एक के भीतर एक झरझरा केवल पत्थर का खंभा embedding द्वारापिपेट टिप, fluidic backpressure उतारा है, निर्वात (यानी पिपेट आकांक्षा) द्वारा प्रवाह नियंत्रण सक्षम बनाता है. यह सुविधा बहुत (चित्रा 1) सरल किया जा करने के लिए मुश्किल नमूना प्रकार से न्यूक्लिक एसिड को शुद्ध करने के लिए आवश्यक निकालने की प्रक्रिया और उपकरण सक्षम बनाता है. केवल पत्थर का खंभा की ज्यामिति और porosity केवल पत्थर का खंभा की मोटाई 1.0 से 5.0 मिलीग्राम से लेकर नमूना संस्करणों के लिए पर्याप्त न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी क्षमता प्रदान करता है, जबकि clogging कम करने के लिए सिलवाया है. नमूना आकांक्षा और वितरण के दौरान द्विदिश प्रवाह नमूना निकालने और कुशल न्यूक्लिक एसिड वसूली और क्षालन के लिए बाध्यकारी केवल पत्थर का खंभा के बीच लंबे समय तक निवास बार के लिए अनुमति देता है, और विंदुक टिप खुद की मात्रा क्षमता से अधिक है कि संसाधित करने के लिए अपेक्षाकृत बड़े नमूना संस्करणों में सक्षम बनाता है. हम पहले से एक एकल या बहु चैनल राय का उपयोग कर nasopharyngeal नमूनों से इन्फ्लूएंजा आरएनए सफ़ाई के लिए एक पुस्तिका TruTip प्रक्रिया के विकास और आवेदन की सूचनाnin pipettor का 15. बराबर निकासी क्षमता 10 6 जीन प्रतियों पर स्वचालित QIAcube और मैनुअल TruTip तरीकों के बीच इन्फ्लूएंजा एक प्रति मिलीलीटर nasopharyngeal aspirate प्राप्त किया गया. इस अध्ययन का उद्देश्य सामान्यतः संदर्भ नैदानिक प्रयोगशालाओं में पाया तरल से निपटने रोबोट का उपयोग nasopharyngeal aspirate (एनपीए) और अन्य चिकित्सकीय प्रासंगिक नमूना प्रकार के मध्यम और उच्च throughput, स्वचालित TruTip न्यूक्लिक एसिड शोधन प्रक्रियाओं, प्रदर्शित करने के लिए किया गया था.
TruTip अवधारणा और कार्यप्रवाह की सादगी (चित्रा 1) यह आसानी से, स्वचालित कुशल और नैदानिक नमूना, matrices इनपुट नमूना संस्करणों, और तरल हैंडलिंग सिस्टम के एक नंबर के लिए प्रभावी, रूपांतरित करना. यह हर नैदानिक नमूना है कि अद्वितीय है, तथापि, मान्यता प्राप्त होना चाहिए, और चिपचिपाहट में अगले करने के लिए एक, विविक्त, बलगम, सतह contaminants, माइक्रोबियल, और / या मानव आनुवंशिक पृष्ठभूमि अलग अलग होंगे. नैदानिक नमूना संरचना और एक स्वचालित TruTip नमूना तैयार प्रोटोकॉल के उद्देश्य से उपयोगों में उम्मीद की विविधताओं को देखते हुए यह इसलिए एक विशिष्ट नमूना प्रकार के लिए वांछित परिणाम प्राप्त करने के क्रम में एक TruTip प्रक्रिया में कुछ कदम को संशोधित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. बावजूद नमूना प्रकार की, लेकिन, आम तौर पर न्यूक्लिक एसिड पवित्रता और / या वसूली पर सबसे महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है कि TruTip पैरामीटर शामिल हैं:
रोबोट चैनल हथियारों को ज्यामिति, पिपेट टिप सामग्री, और लगाव विधि प्रत्येक साधन निर्माता के लिए अद्वितीय हैं क्योंकि, एक अलग TruTip निर्माण प्रत्येक तरल हैंडलिंग प्रणाली के लिए आवश्यक है. TruTip केवल पत्थर का खंभा आयाम (व्यास, मोटाई, और ध्यान में लीन होना आकार) न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी क्षमता (और क्षालन क्षमता) के साथ सहसंबंधी है, के रूप में किसी भी ठोस चरण निष्कर्षण तकनीक के लिए उम्मीद है. मोटी (> 4 मिमी) matrices के बड़ी मात्रा के नमूने और / के लिए न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी क्षमता बढ़ाने के लिए या विशिष्ट TruTip प्रारूपों में बाध्यकारी क्षमता बराबर करने के लिए एक 1 मिलीलीटर TruTip में एम्बेड किया जा सकता है, TruTip मोटाई और प्रवाह की दर के बीच एक tradeoff के दौरान वहाँ है प्रारंभिक बाध्यकारी कदम (कच्चे lysates की उपस्थिति में). इस प्रकार, यह एक स्वचालित प्रोटोकॉल के प्रारंभिक चरणों के लिए बड़ी मात्रा विंदुक युक्तियाँ में बड़े व्यास monoliths एम्बेड करने के लिए कभी कभी फायदेमंद है, (उदाहरण के लिए </ उन्हें> बड़ी मात्रा एक्सट्रेक्शन के लिए 5 मिलीलीटर हैमिल्टन / Akonni TruTips). तरल से निपटने रोबोट के निर्माताओं से निर्धारित विशिष्ट TruTip विन्यास को देखते हुए, हालांकि, हम जरूरी TruTip न्यूक्लिक एसिड पैदावार विभिन्न निर्माताओं से, या अलग TruTip आकार भर में तरल से निपटने प्लेटफार्मों भर में समान होने की उम्मीद नहीं है.
वे सामान्य रूप से बाँझ साइटों (जैसे मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ) से प्राप्त कर रहे हैं जब तक क्लीनिकल नमूने (परिभाषा से) मानव जीनोमिक डीएनए के महत्वपूर्ण मात्रा में शामिल होंगे. अन्य अनुप्रयोगों में मानव डीएनए एक अवांछित जीनोमिक पृष्ठभूमि (चित्रा 5 के रूप में) का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि कभी कभी मानव जीनोमिक डीएनए, (चित्रा 6 में) के रूप में वांछित है. पृष्ठभूमि डीएनए की उपस्थिति आमतौर पर केवल पत्थर का खंभा के बंधन क्षमता अधिक नहीं है नमूने में न्यूक्लिक एसिड की कुल राशि के रूप में लंबे समय के रूप में समस्याग्रस्त नहीं है, और पृष्ठभूमि डीएनए एक वाहक के रूप में काम कर सकते हैं वांछित लक्ष्य न्यूक्लिक अगरएसिड ट्रेस मात्रा में मौजूद है. उच्च मात्रा प्लाज्मा निकासी प्रोटोकॉल (चित्रा 7) के उद्देश्य के लिए सिवाय इसके कि संक्रामक रोग परीक्षण की तैयारी नमूना उद्देश्य के समान है जो मातृ डीएनए के 10-20 गुना अधिक, की उपस्थिति में (खंडित) भ्रूण के डीएनए को अलग करने के लिए है दृश्यों अत्यधिक अनुकूल हैं और केवल अति विशिष्ट आणविक परीक्षण और / या आकार भेदभाव से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. इस मामले में कुल घूम डीएनए एक 5 मिलीलीटर TruTip, और बाद में उच्च आणविक और कम आणविक वजन भ्रूण डीएनए के माध्यम से अलग हो रहे हैं का उपयोग कर अलग है बाध्यकारी बफर की स्थिति बदलकर एक 1 मिलीलीटर TruTip करने के बाद बाध्यकारी और क्षालन. एक सिलिका पत्थर का खंभा के लिए अपने बाध्यकारी और क्षालन गुणों के आधार पर लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड के चुनिंदा आकार जुदाई और संवर्धन झिल्ली या आकार बहिष्कार स्पिन स्तंभों के द्वारा प्राप्त की तुलना में कार्रवाई की एक काफी अलग विधा है. मानव जीनोमिक डीएनए से सूक्ष्म जीवाणु के डीएनए का आकार जुदाई और संवर्धन एक हो सकता हैTruTip बाध्यकारी और क्षालन बफ़र्स अनुरूपण के माध्यम से भविष्य में आवेदन ccomplished.
स्वचालित प्रोटोकॉल यहाँ विभिन्न चिकित्सीय नमूनों के प्रसंस्करण के लिए TruTip केवल पत्थर का खंभा खुद की उपयोगिता, और कैसे यह बड़ी मात्रा में और विशिष्ट तरल से निपटने रोबोट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है पर जोर दिखा. सुव्यवस्थित तरीके आमतौर पर अन्य स्वचालित प्रणाली की तुलना में तेजी से निकासी प्रोटोकॉल में परिणाम. TruTip प्रक्रियाओं को स्वचालित करने के लिए आवश्यक प्राथमिक हार्डवेयर पिपेट चैनल के हाथ खुद के बजाय चुंबकीय छड़, वैक्यूम सिस्टम है क्योंकि TruTip प्रौद्योगिकी की सादगी, तथापि, यह भी एक नया, स्वचालित न्यूक्लिक एसिड शोधन प्रणाली खरीदने में रुचि रखने वालों के लिए कुछ लागत लाभ देता है , या पर बोर्ड सेंट्रीफ्यूज. पहले से भरे अभिकर्मक प्लेटों का उपयोग भी अंतरिक्ष और आवश्यक उपभोग्य कम करने, और रन प्रति throughput को दोहरा सकते हैं. TruTip प्रोटोकॉल के साथ डेक अंतरिक्ष न्यूनतम भी एकीकृत करने के लिए उन्नत उपयोगकर्ताओं को सक्षम नदी के ऊपर या घTruTip साथ ownstream स्वचालित प्रक्रिया. उदाहरण के लिए fractionate पूरे रक्त के लिए हैमिल्टन easyBlood समाधान काफी जैव बैंकिंग प्रक्रियाओं को सरल होगा जो स्वचालित TruTip निष्कर्षण विधि के साथ शामिल किया जा सकता है. ऐसे न्यूक्लिक एसिड quantitation, सामान्य, पीसीआर सेट अप, या डीएनए अनुक्रमण के रूप में बाद के निष्कर्षण प्रक्रियाओं को भी आसानी से बड़ा तरल से निपटने प्लेटफार्मों पर TruTip के साथ एकीकृत कर रहे हैं.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के भाग अनुदान आर 44 AI072784 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) द्वारा समर्थित थे. हम डॉ. कर्स्टन सेंट जॉर्ज, सारा बी GRIESEMER, डेरिल Lamson और वायरल रोगों, वड्सवर्थ केंद्र, मात्रा निर्धारित इन्फ्लूएंजा virions और नैदानिक पुष्टि इन्फ्लूएंजा वास्तविक समय के लिए उपयोग करने के लिए नई स्वास्थ्य के न्यूयॉर्क राज्य विभाग की प्रयोगशाला के एमी डीन धन्यवाद पीसीआर assays.
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |