TruTip er en enkel nukleinsyreekstraheringsenheten teknologi hvorved en porøs monolittisk bindende matrise settes inn i en pipettespiss. Følgelig er prøveopparbeidelse format som er kompatibelt med de fleste væskehåndtering instrumenter, og kan brukes til mange middels til høy gjennomstrømning kliniske applikasjoner og prøvetyper.
TruTip er en enkel nukleinsyreekstraheringsenheten teknologi hvorved en porøs monolittisk bindende matrise settes inn i en pipettespiss. Geometrien i monolitten kan tilpasses til spesifikke pipettespisser som varierer i volum 1,0 til 5,0 ml. Den store porøsiteten til monolitten muliggjør viskøse eller komplekse prøver til lett å passere gjennom med minimal fluidteknisk mottrykk. Toveis flyt maksimerer oppholdstid mellom monolitten og prøve, og gjør store prøven volumer som skal behandles innen en enkelt TruTip. De grunnleggende trinn, uavhengig av prøvevolum eller TruTip geometri, omfatter cellelyse, nukleinsyre binding til de indre porene i TruTip monolitt, vaske bort ubundet prøvekomponenter og lysis buffere, og eluere renset og konsentrert nukleinsyrer i en egnet buffer. Attributtene og tilpasningsevne av TruTip er vist i tre automatiserte kliniske utvalgets behandling protokoller ved hjelp av en Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR og STARPLUS væskehåndtering roboter, inkludert RNA isolert fra nasofaryngealt aspirate, genomisk DNA isolert fra fullblod, og fosterets DNA-ekstraksjon og berikelse av store volumer av maternal plasma (henholdsvis).
Nukleinsyrerensing er nødvendig for de fleste molekylær diagnostikk, forskning bruk og life science applikasjoner. Forskjellige tilnærminger har kommet siden tidspunktet for fenol / kloroform ekstraksjoner, mange av hvilke er basert på det grunnleggende prinsipp av nukleinsyren bindes til silisium i nærvær av chaotropiske salter 1. Utpakkingen har blitt strømlinjeformet og automatisert gjennom bruk av ulike perle-og membran-baserte formater, med spin filtre, magnetiske perler og relaterte tilnærminger dominerer biovitenskap (se eksempler i 2-13). Mens effektive, har partikler og membraner kjent begrensninger når konfrontert med utfordrende kliniske matriser. For eksempel, membraner og perle-baserte kolonner er kompatibel, har små porer størrelser (og dermed høye mottrykk), og kreve noen form for støtte for å bli behandlet av en sentrifuge eller vakuum system. De fysiske egenskapene til membraner og vulsten kolonner førerbetydelig fluidteknisk motstand, noe som begrenser den type prøver som kan behandles effektivt uten tilstopping av forbruksmateriell, og / eller det totale (inngang) prøvevolum som kan være uni-retningsbores behandlet gjennom strømningsbanen. I motsatt fall må magnetiske partikler bli distribuert over hele prøven ved omrøring. Behovet for å homogent fordele magnetiske partikler i en løsning begrenser den tilførte prøvevolum som kan behandles med de magnetiske kuler forbruksvarer. Prøvematerialet attributter (for eksempel viskositet eller kompleksitet) kan føre til ineffektiv magnetisk partikkelkonsentrasjon på siden av et rør eller en stang. I tillegg kan fin silika partikler løsner av perlene under utpakkingen, mister sin magnetisering og forurenser den endelige prøven.
Den TruTip teknologien ble utviklet for å overvinne noen av disse nukleinsyre sample behandle begrensninger og begrensninger 14. Ved å bygge en porøs monolitt innen enpipette spissen, fluidic mottrykk er senket, noe som gjør det mulig flyt kontroll av vakuum (dvs. pipette aspirasjon). Denne funksjonen gjør at utpakkingen og instrumentering kreves for å rense nukleinsyrer fra vanskelige prøvetyper å være sterkt forenklet (figur 1). Geometrien og porøsiteten til monolitten er skreddersydd for å minimalisere tilstopping, mens tykkelsen av monolittmaterialet gir tilstrekkelig nukleinsyre-bindende kapasitet for prøvemengder som strekker seg 1,0 til 5,0 ml. Toveis volumstrøm ved prøven aspirasjon og dispensering tillater lengre oppholdstider mellom prøven ekstrakt og bindingen monolitten for effektiv nukleinsyre utvinning og eluering, og muliggjør relativt store prøvevolumer for å bli behandlet som overskrider volumkapasiteten av pipettespissen selv. Vi har tidligere rapportert utvikling og anvendelse av en manuell TruTip prosedyre for rensing av influensa RNA fra nasofaryngeale prøver ved hjelp av en enkelt-eller flerkanals Rainin pipetten 15. Tilsvarende utvinning effektivitet ble oppnådd mellom automatisert Qiacube og manuelle TruTip metoder på 10 6 genkopier influensa A per ml nasofaryngealt aspirate. Målet med denne studien var å vise middels og høy gjennomstrømning, automatiserte TruTip nukleinsyrerensing prosedyrer for nasofaryngealt aspirate (NPA) og andre klinisk relevante prøvetyper, ved hjelp av væskehåndtering roboter som vanligvis finnes i referanse kliniske laboratorier.
Enkelheten i TruTip konsept og arbeidsflyt (figur 1) gjør det lett tilpasses, automatisert, effektive for en rekke kliniske prøven matriser, input prøvemengder, og flytende håndteringssystemer. Det bør bli anerkjent imidlertid at hver prøvematerialet er unik, og vil variere den ene til den neste i viskositet, partikler, slim, overflateforurensninger, mikrobielle, og / eller humane genetiske bakgrunner. Gitt forventet variasjon i klinisk prøve sammensetning og tiltenkte bruk av en automatisert TruTip prøveopparbeidelse protokoll, kan det derfor være nødvendig å endre enkelte trinn i en TruTip prosedyre for å oppnå ønskede resultater for en spesifikk prøvetype. Uavhengig av prøvetype imidlertid TruTip parametere som typisk har størst virkning på nukleinsyre renhet og / eller gjenvinning omfatter:
Fordi geometri, pipette tips materiale, og vedlegg metode for å robot kanal armene er unike for hvert instrument produsent, er en annen TruTip konstruksjon kreves for hver flytende håndteringssystem. De TruTip monolitt dimensjoner (diameter, tykkelse og pore størrelse) ikke korrelerer med nukleinsyre bindende kapasitet (og eluering effektivitet), er som forventet for noen solid-fase ekstraksjon teknikk. Mens tykke (> 4 mm) matriser kan være innebygd i en 1 ml TruTip å øke nukleinsyre-bindende kapasitet for stort volum prøver og / eller utjevne bindingskapasitet på tvers av bestemte TruTip formater, er det en avveining mellom TruTip tykkelse og strømningsmengder i løpet den innledende binding trinn (i nærvær av rå lysater). Dermed er det noen ganger en fordel å legge større diameter bautasteiner i større volum pipette tips for de første trinnene i en automatisert protokoll, (f.eks </ Em> de 5 ml Hamilton / Akonni TruTips for stort volum utdrag). Gitt de spesifikke TruTip konfigurasjoner diktert av produsentene av væskehåndtering roboter, derimot, trenger vi ikke nødvendigvis forvente TruTip nukleinsyre gir å være identisk på tvers væskehåndtering plattformer fra forskjellige produsenter, eller på tvers av ulike TruTip størrelser.
Kliniske prøver (per definisjon) vil inneholde betydelige mengder av humant genomisk DNA med mindre de er kjøpt fra normalt sterile områder (f.eks cerebral spinal væske). Noen ganger er det humant genomisk DNA er ønsket (som i figur 6), mens i den andre anvendelser humant DNA representerer en uønsket genomisk bakgrunn (for eksempel på figur 5). Tilstedeværelsen av DNA bakgrunn er vanligvis ikke problematisk, så lenge den totale mengde av nukleinsyre i prøven, ikke overskrider bindingskapasiteten av monolitten, og bakgrunnen DNA kan tjene som en bærer hvis ønsket target nukleinsyre er tilstede i spormengder. Formålet med høyt volum plasma ekstraksjon protokoll (figur 7), er å isolere (fragmenterte) føtalt DNA i nærvær av et 10-20 gangers overskudd av mors-DNA, som er lik den prøvepreparering målet for smittsomme sykdommer tester, bortsett fra at sekvensene er svært kongruente og kan bare skilles ved meget spesifikke molekylære testing og / eller størrelse diskriminering. I dette tilfellet er totalt sirkulerende DNA isolert ved hjelp av en 5 ml TruTip, og påfølgende høymolekylær og lavmolekylær vekt føtalt DNA blir separert gjennom påfølgende binding og eluering på en 1 ml TruTip ved å endre bindingsbuffer forhold. Selektiv størrelse separasjon og berikelse av målet nukleinsyrer basert på deres bindende og eluering egenskapene til en silika monolitt er en vesentlig annen virkningsmekanisme enn oppnås ved membraner eller størrelseseksklusjonstrinn spin kolonner. Størrelse separasjon og anrikning av mikrobiell DNA fra humant genomisk DNA kan være enccomplished i fremtidige søknader via tilpassing TruTip bindende og eluering buffere.
De automatiserte protokoller demonstrert her understreke nytten av TruTip monolitten seg for å behandle ulike kliniske prøver, og hvordan det kan tilpasses for store volumer og spesifikke væskehåndtering roboter. Den strømlinjeformede metoder typisk resultere i raskere utvinning protokoller i forhold til andre automatiserte systemer. Enkelheten av TruTip teknologi, derimot, gir også noen kostnadsfordeler for de som er interessert i å kjøpe en ny, automatisert nukleinsyrerensing system, fordi den primære maskinvaren som kreves for å automatisere TruTip prosedyrer er pipetten kanal arm selv heller enn magnetiske stenger, vakuum systemer , eller om bord sentrifuger. Utnytte forhåndsutfylte reagenser plater kan også redusere plass og nødvendige forbruksvarer, og doble gjennomstrømningen per løp. Minimere dekksplass med TruTip protokoller gjør også avanserte brukere å integrere oppstrøms eller downstream automatiserte prosesser med TruTip. For eksempel Hamiltons easyBlood løsning på fraksjonerer fullblod kan bli innlemmet med den automatiserte TruTip utvinning metoden, som i betydelig grad ville effektivisere bio-bank prosesser. Post-ekstraksjonsprosesser for eksempel nukleinsyrekvantifisering, normalisering, PCR oppsett, eller DNA-sekvensering er også lett integreres med TruTip på de større flytende håndtering plattformer.
The authors have nothing to disclose.
Deler av dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) i henhold til stipend R 44 AI072784. Vi takker Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson og Amy dekan ved Laboratory of Viral Diseases, Wadsworth sentrum, New York State Dept. of Health for tallfestede influensavirioner og tilgang til klinisk validert influensa sanntid PCR-analyser.
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |