Summary
Des études de développement chez la souris sont entravés par l'inaccessibilité de l'embryon pendant la gestation. Afin de promouvoir la culture à long terme du cœur embryonnaire à un stade avancé de gestation, nous avons développé un protocole dans lequel le cœur excisé est cultivé dans un semi-solide, Matrigel dilué.
Abstract
Des études de développement chez la souris sont entravés par l'inaccessibilité de l'embryon pendant la gestation. Ainsi, les protocoles d'isoler et de culture différents organes d'intérêt sont indispensables pour fournir une méthode de deux stratégies de traitement novatrices visualisation changements dans le développement et permettant. Afin de promouvoir la culture à long terme du cœur embryonnaire à un stade avancé de gestation, nous avons développé un protocole dans lequel le cœur excisé est cultivé dans un semi-solide, Matrigel dilué. Ce substrat fournit une aide suffisante pour maintenir la structure en trois dimensions, mais est suffisamment souple pour permettre la contraction continue. En bref, les coeurs sont excisés de l'embryon et placés dans un mélange de Matrigel froid dilué 1:1 avec le milieu de croissance. Après le Matrigel dilué se solidifie, le milieu de croissance est ajouté à la boîte de culture. Coeurs excisées aussi tard que jour embryonnaire 16,5 étaient viables pendant quatre jours après dissection. Analyse du plexus coronaire montre que cette méthode ne tient pasperturber le développement vasculaire coronaire. Ainsi, nous présentons une nouvelle méthode de culture à long terme des cœurs embryonnaires.
Introduction
Ces dernières années, la souris transgénique a été le système de modèle prédominant pour l'étude des malformations cardiaques de développement. Toutefois, d'autres organismes modèles tels que le poisson-zèbre, se sont avérés avoir des avantages significatifs par rapport à la souris. Trois avantages majeurs du poisson zèbre sont la pose externe des œufs, pour faciliter l'accès à des embryons; la transparence optique des embryons, ce qui permet une visualisation facile du développement cardiaque, et la facilité d'application de petites traitements moléculaires pour moduler le développement de l'embryon 1. Ainsi, le développement d'une technique de culture qui a permis la croissance des ex utero d'un organe embryonnaire serait contourner, au moins en partie, les limitations actuellement rencontrées par les chercheurs qui étudient les processus de développement chez les souris transgéniques.
Systèmes de culture cardiaques ex vivo ont été développés à la fois le poussin et embryon de souris qui permettent un traitement avec de petites molécules et des analyses de façon difrentes régions du cœur communiquent 2-6. Pour la culture de cœur de souris ensemble, coeurs prélevées sur des embryons jusqu'à embryonnaire (E) 12.5 de l'âge peut être placé dans un milieu de culture avec ou sans balancement 2,3,5. Grâce à cette technique, les cœurs embryonnaires ont été incubées avec succès à l'équivalence des E13.5, et les cœurs cultivés avec rocking ont été maintenus aussi longtemps que trois jours (à partir de E10.5) 3. Cependant, aucune étude n'a rapporté la culture réussie des cœurs d'embryons âgés. De même, les expériences de sauvetage ont été limitées à l'application de l'agent thérapeutique au niveau mondial pour le milieu de culture 2.
Un système de culture de tranche, dont les cœurs sont excisées, intégrées, et sectionné à l'aide d'un vibratome, a également été utilisé pour les deux cœurs jeunes, comme E12.5 cœurs de souris et Hamburger-Hamilton stade 36 (environ E16 chez la souris) cœurs chiches 2,4,6, et plus cœurs, comme post-natal et adulte souris heArts et les coeurs humains adultes 7,8. Bien que les analyses embryonnaires sont généralement utilisés sections épaisses de 150 um 2,4, épaisseur de coupe peut être un excellent jusqu'à 500 um sans preuve d'un manque d'oxygène 8. Ces cultures de tranche ont été maintenus aussi longtemps que deux mois en culture, avec la plupart des tranches de maintenir la contractilité tout au long de cette période 9. Par rapport aux études dans les cardiomyocytes isolés, ces cultures de tranche permettent la co-culture de cardiomyocytes avec leurs types de cellules voisines et fournissent une méthode utile pour l'analyse ex vivo. Cependant, ces cultures nécessitent plus élaborée set-up que de simplement placer un coeur dans un milieu de culture (par exemple intégrer le cœur vivant de sectionnement sur un vibratome), et toute analyse est évidemment limitée à la partie du cœur au sein de la section.
Compte tenu des limites décrites ci-dessus pour la culture des cœurs embryonnaires de souris et la richesse des souris transgéniques available pour l'étude, nous avons développé un système ex vivo de souris de coeur de culture similaire à un système de culture du poumon ex vivo développé par Weaver, et 10 Notre système de culture al. permet culture à long terme et la visualisation de la rénovation circulation coronaire au sein de l'ensemble cœurs embryonnaires de souris. En outre, l'utilisation de Matrigel permet perles pour être maintenus en place à proximité du centre, offrant ainsi un traitement localisé avec des agents thérapeutiques. Ces expériences peuvent être réalisées à différents moments du développement de comparer l'effet d'un traitement donné sur un processus tels que la formation de l'artère coronaire. Parce que les petites molécules peuvent diffuser à travers le Matrigel, ce système de culture peut également être utilisé pour la culture des régions disséquées du cœur près de l'autre afin de déterminer si des contacts entre cellules spécifiques sont nécessaires pour certains processus de développement ou si la signalisation paracrines d'une région à l'autre est nécessaire.
Ce système de cultureest relativement simple et, contrairement au système de culture de tranche, fait appel à des réactifs de culture de base et les set-ups qui sont facilement disponibles dans la plupart des laboratoires. En bref, cœurs embryonnaires excisés sont cultivées en Matrigel dilué, qui fournit un support semi-solide. Ce support est suffisante pour maintenir la morphologie tridimensionnelle du coeur, tout en permettant la contraction du coeur. Grâce à ce système, coeurs entiers de plus d'embryons de souris (E14.5-E16.5) peuvent être maintenues en culture pendant quatre jours. L'ensemble du plexus coronaire est maintenue, contrairement aux cultures de tranche, donc aucun repère de signalisation qui se produisent dans différentes régions du cœur restent présents. En outre, les colorants fluorescents des cellules vivantes peuvent traverser le Matrigel pour permettre la visualisation du cœur live, et des perles en protéines conjugués peuvent être placés à proximité du coeur de fournir une source de signalisation localisée. Ensemble, ces avantages font de cette technique une méthode idéale pour étudier les processus de développement dans l'embryonic cœur de la souris.
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Protocol
1. Exciser les coeurs embryonnaires
- Euthanasier une souris timed-enceinte au jour embryonnaire désirée à l'aide d'une technique d'euthanasie approuvé. Toutes les expériences ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.
- Généreusement pulvériser la femelle avec de l'éthanol à 70% avant la dissection. Ouvrez la cavité abdominale de la femelle pour récupérer et exciser la corne utérine.
- Placez la corne utérine dans une boîte de Pétri contenant froid 1x saline tamponnée au phosphate (PBS) et rincer si nécessaire. Couper la corne utérine via la ligne médiane pour exposer les sacs embryonnaires joints.
- Couper un sac embryonnaire et récupérer un embryon. Placez l'embryon dans une seconde boîte de Pétri avec du PBS froid. Retourner la boîte de Pétri avec la corne utérine à la glace.
- Décapite l'embryon pour améliorer l'accès à la paroi thoracique. Si génotypage est nécessaire, enlever et sauver la queue dans un tube Eppendorf placé sur la glace.
- Avec l'embryon sur le dos, coupé ouvrir la cage thoracique pour visualiser le cœur et les poumons. Selon le stade, la paroi thoracique peut être transparent.
- Soulevez délicatement le cœur à l'aide des pinces et couper les vaisseaux ci-dessous. Ensuite, coupez au-dessus des grands vaisseaux de libérer le cœur. Si nécessaire, enlever les tissus étrangers.
- Placez le cœur dans un puits d'une plaque de 24 puits rempli de PBS froid et placez le plat sur la glace.
- Répéter les étapes précédentes jusqu'à cœurs ont été supprimés de tous les embryons.
2. Culture Set-up
- Dans une hotte laminaire, combiner Matrigel froid et le milieu de culture souhaitée (par exemple 10% de sérum de veau fœtal (FBS) en milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM)) à un ratio de 1:1. Ne pas préchauffer le milieu de culture.
- Garder le Matrigel dilué sur la glace, pipette 500-1000 ul de la solution diluée dans un puits d'une boîte de culture de 24 puits qui est également maintenu sur la glace.
- Dans la hotte, choisissez soigneusement et placer le exciséecoeur dans un puits de la boîte de culture Matrigel contenant tout en gardant la boîte de culture sur la glace.
- Si l'orientation du cœur embarqué est cruciale: pulvériser généreusement un microscope inversé et l'espace environnant avec 70% d'éthanol. Dans la hotte, mettre le cœur excisé dans un puits de la plaque de culture Matrigel contenant tout en restant sur la glace. Ensuite, placer la plaque sur un microscope et orienter rapidement le coeur d'exciser le Matrigel commence à se solidifier.
- Placez la boîte de culture dans un incubateur humidifié 37 ° C incubateur (5% de CO 2) et laissez le Matrigel à solidifier pendant environ 30 min.
- Ajouter 1 milieu de culture préchauffé ml dans chaque puits contenant un cœur.
- Coeurs peuvent rester en culture pendant au moins quatre jours. Changer le milieu de culture tous les deux jours est recommandée.
3. Fixation et visualisation
- Si désiré, ajouter un colorant fluorescent des cellules vivantes (par exemple Syto-16) pour visualiser le cœur en direct. Photographie seralimité à la partie du coeur qui est visible en fonction de la position dans laquelle elle a été intégrée.
- Si les analyses post-culture (par exemple, l'imagerie mont tout ou coupe) seront effectuées, éliminer le milieu de culture et le remplacer par le froid 4% de formaldéhyde. Placer le plat sur la glace pendant 30 min.
- Après le formaldéhyde froid et de la glace favorisent la dissolution du Matrigel, remplacer le fixateur (et Matrigel) avec le formaldéhyde fraîche et fixer des coeurs pendant une nuit à 4 ° C.
- Laver les cœurs avec tampon (par exemple PBS ou Tris) et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que des analyses plus poussées.
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Representative Results
Grâce à cette technique, le cœur conserve sa morphologie tridimensionnelle et reste viable, comme indiqué par les contractions continues (Film 1). Ces contractions sont toujours plus importante dans les oreillettes que dans les ventricules. Après la culture, coeurs peuvent être fixés et traités soit pour l'immunohistochimie ou histologie pour examiner l'expression de marqueurs spécifiques ou des structures. Figure 1A montre la base des ventricules et les grandes artères d'un coeur embryonnaire de la souris qui a été cultivé pendant 24 heures, fixé, et traitées pour immunohistochimie pour marquer l'endothélium. Ces microscope confocal démontrent que la vascularisation coronaire apparaît semblable à un cœur excisé à partir d'un embryon comparables ans qui a été maintenu dans l'utérus (figure 1B). Cependant, les vaisseaux coronaires du cœur cultivées ex vivo n'apparaissent plus faible que dans le cœur qui a été maintenu in utero. Dans les deux cœurs, ee apex des ventricules ont été retirées pour permettre un meilleur accès de l'anticorps au tissu.
Hématoxyline et l'éosine (H & E) l'analyse des cœurs excisés à E16.5 et cultivées ex vivo pendant 4 jours démontre que la morphologie globale, y compris les murs des grandes artères (figure 2A) et le ventricule et interventriculaire myocarde septal (figure 2B) le cœur reste intact. Malgré l'absence de circulation, des ostia coronaires sont apparents (figure 2A). Cependant, fragmentation de l'ADN, observée à la fois avec H & E (Figures 2A, 2B) et DAPI (données non présentées), est apparente dans le myocarde compact et autour des gros vaisseaux. En outre, le myocarde est moins dense en comparaison avec un cœur d'un embryon qui s'est développé -18,5 in utero (figures 2C, 2D), même si le cœur cultivées ex vivo battait encore. Ainsi, il ya des limites à la longueurde temps pour ou le stade auquel ces cœurs peuvent être maintenus.
Cette technique de culture peut également être utilisé pour étiqueter fluorescence cœurs tandis que dans la culture. Dans ce cas, les cœurs sont cultivées pendant 48 heures après avoir été incubées avec un colorant fluorescent spécifique de l'endothélium. Dans ce cas, la visualisation est limité en fonction de l'orientation du cœur et de l'opacité du tissu (figures 3A, 3B). Toutefois, des coupes histologiques subséquentes à travers le myocarde ventriculaire confirment que cette molécule fluorescente peut pénétrer dans les couches cellulaires externes pour étiqueter les navires sous-épicardique dans les ventricules (figures 3C, 3D), et ce colorant fluorescent colocalise avec iso-lectine (figure 3D).
Figure 1. Développement semble normal dans des conditions ex vivo. (A) Après 24 h de culture ex vivo cœurs de E14.5 embryons ont été fixés, marquées avec un marqueur endothélial (vert), effacés, et imagées par microscopie confocale. L'artère pulmonaire (AP), l'aorte (Ao), et la base du cœur sont affichés. (B) coeurs excisés de E15.5 embryons qui se sont développées in utero ont été traitées de manière similaire. La barre d'échelle, 100 um.
Figure 2. La morphologie est grossièrement maintenue pendant culture ex vivo. (A, B) coeurs ont été excisées à partir de E16.5 embryons et cultivées ex vivo pendant 4 jours. Cœurs étaient alors sectionnés et colorés avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H & E). (A) une section transversale montrant l'alignement de l'aorte (Ao) et l'artère pulmonaire (AP). Un des ostia coronaires (pointe de flèche) est visible. Le myocarde surarrondir l'aorte est moins dense que dans la commande (C), et une certaine fragmentation nucléaire (flèche) est également présent. (B) La morphologie générale du myocarde compact des ventricules et le septum interventriculaire (SIV) apparaît normale, mais l' myocarde est moins dense que dans le contrôle (D), et une certaine fragmentation nucléaire (flèche) est visible dans l'IVS. (C, D) A titre de comparaison, frontal H & E-sections colorées à partir d'un cœur -18,5 sont affichés. (C) Un orifice coronaire est observé à côté de la zone d'occupation (pointe de flèche). (D) Le septum interventriculaire est bien définie. Barre d'échelle, 70 um.
Figure 3. Ex vivo cœurs peuvent être marqués par fluorescence au cours de la culture. (A, B) Après 48 h de culture ex vivo cœurs deE16.5 embryons ont été incubées avec Syto 16 (vert) pendant 1 heure, et la fluorescence peuvent être observées aussi tard que 48 h après l'incubation. (C, D) Cette fluorescence a été maintenue par sectionnement gelé et a pu être observé dans les cellules épithéliales sous-épicardiques dans le myocarde ventriculaire. En D, la section dans le myocarde ventriculaire a été co-marquée avec iso-lectine (rouge). Les co-étiquettes iso-lectine les cellules vertes SYTO 16 positifs (flèches) et des labels aussi des vaisseaux dans le myocarde qui ne sont pas tachés avec Syto 16. AB, grossissement 4x; barre d'échelle en CD, 120 um.
Film 1. Après la culture ex vivo pendant 30 heures, un cœur excisé à partir d'un embryon E14.5 montre contractilité cohérente et une stimulation entre les oreillettes et les ventricules. Cliquez ici pour voir le film .
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Discussion
Le système de culture actuelle pose des avantages significatifs pour les études cardiaques embryonnaires de souris. Ce système de culture préserve la contractilité du myocarde et le plexus coronaire, avec des signes limités de nécrose, même après quatre jours de culture. En outre, la matrice semi-solide fournit un soutien suffisant pour maintenir la morphologie tridimensionnelle du coeur en développement, tout en permettant une flexibilité de contrat et également pour maintenir des perles revêtues en place au cours de la culture. Malgré ce soutien, cette matrice est perméable aux colorants fluorescents tels que Syto 16, permettant fluorescent analyse du cœur live.
Les méthodes de culture Tranche placent la section de coeur, contenant sa part du plexus coronaire, sur une membrane poreuse à l'interface air-liquide pour maintenir une oxygénation par capillarité 7. En revanche, les méthodes de culture de tout son cœur précédentes s'appuient sur des études à bascule et restreint aux âges embryonnaires avant un vasculat coronaire fonctionnelleure est nécessaire 2,3,5. En utilisant la technique actuelle, cependant, les cœurs peuvent facilement être cultivées après le plexus coronaire a formé sans la complexité supplémentaire d'une interface air-liquide.
En dépit de nos préoccupations que les cœurs embryonnaires tardives (par exemple E16.5) deviendrait nécrotique après une longue période de temps dans la culture, seulement une nécrose limitée a été observée après quatre jours de culture (soit l'équivalent d'une journée post-natal 1 cœur). Le protocole original, telle que pratiquée à l'aide bourgeons pulmonaires embryonnaires, 10 n'ont signalé aucune nécrose, mais aussi les poumons utilisés par de précédents embryons mis en scène. Ainsi, la nécrose peut être évitée en limitant études à des moments plus tôt embryonnaires.
Ce système de culture ex vivo a ses limites. Après deux jours de culture, l'épicarde commence la diffusion de la matrice, et dans les quatre jours, l'épicarde attache à la boîte de culture. Parce que l'excroissance épicardique biches pas d'incidence sur la visualisation, cependant, ce problème peut être d'une importance primordiale pour les études épicardique. Aux stades analysé ici (E14.5-E16.5), l'épicarde a depuis longtemps englobé le cœur 11 et a fourni des signaux au plexus développement 12; donc, son excroissance ne semble pas avoir d'effets négatifs sur le plexus coronaire. En outre, le cœur de la culture semblent cesser de croître plus comme leurs homologues dans utero. Une autre limitation est que le coeur embryonnaire de la souris n'est pas transparent comme l'embryon de poisson zèbre. Toute visualisation en direct est donc limité à ce qui peut être observé sur les couches extérieures du cœur. Toutefois, un marqueur endothélial direct peut suffisamment perméat cœur d'étiqueter certains des plexus coronaire et est visible dans la culture.
Malgré ces limites, nous nous attendons à ce que cette méthode de culture ex vivo sera utile pour un certain nombre d'applications. La grande variété de souris transgéniques lignes de cette voituretypes de cellules marquées par fluorescence ry pourraient facilement être utilisés pour évaluer les différents aspects du développement en utilisant l'imagerie time-lapse. En outre, le traitement des embryonnaire cœurs ex vivo avec de petits composés moléculaires, que ce soit nouveau ou déjà en usage clinique, seront faciles à réaliser et imite comment thérapies médicamenteuses sont appliquées chez l'homme.
En conclusion, nous avons adapté une méthode de culture ex vivo pour le coeur embryonnaire de la souris. Cette technique permet un accès facile aux organes qui seraient autrement inaccessibles, tels que le foie ou les reins, au cours du développement et permettra la manipulation et l'analyse en direct de ces organes.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Andrea Portbury pour la lecture critique du manuscrit et le NIH (subvention n R01HL061656) pour le soutien financier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
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