Identificazione Peptide-based di Motivi funzionali e dei loro partner di legame
Summary
Tecniche di sezionare i meccanismi alla base della secrezione del virus HIV-1 Nef in exosomes sono descritti. Peptidi brevi specifici derivati dalla Nef e trasfezione di proteine sono stati sfruttati per determinare la struttura, la funzione, e partner di legame di di Nef secrezione Modification Regione. Queste procedure hanno rilevanza generale in molti studi meccanicistici.
Abstract
Brevi peptidi specifici derivati da motivi trovati nelle proteine integrali, nel nostro caso di HIV-1 Nef, conservano non solo la loro funzione biologica, ma possono anche inibire competitivamente la funzione della proteina intera. Un insieme di 20 Nef peptidi di scansione, 20 aminoacidi di lunghezza con ogni sovrapposizione di 10 amminoacidi del suo vicino di casa, sono stati utilizzati per identificare i motivi in Nef responsabile per la sua induzione di apoptosi. Peptidi contenenti tali motivi apoptotico indotto apoptosi a livelli comparabili alla proteina Nef intera lunghezza. Un secondo peptide, derivato dal Modification Regione secrezione (SMR) della Nef, ha mantenuto la capacità di interagire con le proteine cellulari coinvolte nella secrezione di Nef in exosomes (exNef). Questo peptide SMRwt stata utilizzata come proteina "esca" in esperimenti di co-immunoprecipitazione per isolare proteine cellulari che si legano specificamente alla SMR motivo di Nef. Proteina trasfezione e anticorpo inibizione è stato utilizzato per interrompere fisicamente la scommessa interazioneween Nef e mortalin, una delle proteine SMR vincolanti isolate, e l'effetto è stato misurato con un test di secrezione exNef fluorescente-based. La capacità del peptide di SMRwt outcompete full-length Nef per le proteine cellulari che legano il motivo SMR, ne fanno il primo inibitore della secrezione exNef. Così, impiegando le tecniche descritte qui, che utilizzano le proprietà uniche di brevi peptidi specifici derivati da motivi trovati nelle proteine integrali, si può accelerare l'identificazione di motivi funzionali nelle proteine e lo sviluppo di inibitori basati sul peptide di funzioni patogeni.
Introduction
Con l'avvento della terapia antiretrovirale, l'epidemia di AIDS nel mondo occidentale è stato rallentato, ma non ridotto, e la diffusione di HIV continua ad essere un grave problema di salute in tutto il mondo. Con l'eccezione del marginalmente efficace prova RV144 Thai, vaccini contro l'HIV hanno finora dimostrato incapacità di proteggere dalle infezioni. Così, la ricerca di ulteriori potenziali bersagli terapeutici, è ancora giustificata.
Insieme con CD4 deplezione delle cellule T, persistente attivazione immunitaria generalizzata è un marchio di garanzia di infezione da HIV. L'attivazione immunitaria cronica (CIA) implica un miglioramento della turnover cellulare, sottopopolazioni linfocitarie attivate e differenziate, stanchezza e la senescenza cellulare, e l'uccisione delle cellule T e le cellule B mediante l'attivazione indotta Cell Death (AICD) 1,2,3, e esso è ben definito come uno dei più forti predittori di progressione della malattia 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Tuttavia, i meccanismi alla base della CIA e CD4Deplezione di infezione da HIV delle cellule T devono ancora essere completamente chiarito.
La prova dal nostro laboratorio e altri ci ha portato a un modello di progressione della malattia (Figura 1) in cui la proteina Nef di HIV (fattore di regolazione negativa) induce la secrezione di exosomes da HIV-1 le cellule infette 13,14. Questi exosomes Nef contenenti (exNef) inducono apoptosi in un certo numero di linee cellulari tra cui cellule CD4 non infetti le cellule T 15,16. In alternativa, nei monociti / macrofagi exNef altera i pattern di espressione genica, ad esempio, l'espressione di citochine, e sembra indurre uno stato di attivazione del sistema immunitario non in programma. Questo corpo di evidenza suggerisce un ruolo importante per exNef nella CIA e CD4 deplezione delle cellule T.
La comprensione dei meccanismi alla base della capacità di Nef di manipolare il percorso traffico exosomal sarà utile in nuovi inibitori di ingegneria di secrezione exNef. Inibizione della secrezione exNef dovrebbe diminuire il CD4 deplezione di cellule Te la CIA che guidano l'HIV / AIDS patogenesi.
Per raccogliere le prove che hanno portato il nostro modello di progressione della malattia da HIV / AIDS ei dati successivi che hanno costruito su questo modello, abbiamo sviluppato una serie di nuovi reagenti e delle metodologie che ci ha permesso di analizzare la genetica di secrezione exNef, e cominciamo a determinare la proteine cellulari coinvolte. Nel lavoro iniziale, abbiamo scoperto che la proteina Nef induce apoptosi nelle cellule bystander extracellulare e viene rilasciato dalle cellule transfettate Nef e HIV-infetti 15. Peptidi derivati da (cellula stromale Derived Factor-1, con l'alfa splicing alternativo) SDF-1α erano stati precedentemente dimostrato di mantenere gran parte della attività di legame e segnalazione della molecola intera lunghezza 17. Abbiamo ipotizzato che i peptidi di Nef potrebbero mantenere alcune delle attività apoptotica della proteina integrale, e che questi peptidi sarebbero necessariamente contenere il dominio apoptotico Nef (s). Per identificare questi peptidi, e di conseguenza la Nefdominio apoptotica (s), si ottiene un insieme di 20 HIV-1 Nef peptidi scansione dal AIDS Research NIH e Programma reagente di riferimento. Questi peptidi 20-AA, ogni sovrapposizione di 10 amminoacidi del suo vicino di casa, prendono il nome dal numero del loro ultimo aminoacido, cioè N20 campate Nef aminoacidi 1-20, N30 campate Nef aminoacidi 11-30, ecc 16. Abbiamo trovato che esponendo cellule T extracellulare di peptidi specifici sovrapposti due domini distinti 10-aa nella proteina Nef intera lunghezza apoptosi indotta in queste cellule. Successiva analisi di questi peptidi apoptotici Nef-derivati rivelato la loro capacità di interagire fisicamente con il recettore della chemochina CXCR4 sulla superficie delle cellule T, con cinetiche di legame che permettevano questi peptidi di inibire competitivamente vincolante tra CXCR4 e il suo ligando naturale SDF-1α. Infine, l'interazione dei peptidi derivati Nef-apoptotiche 'con CXCR4 è stato trovato per indurre una risposta allo stress in queste T-cellule portano all'apoptosi. Questa prova ci ha permesso di Quicdomini funzionali di kly mappa Nef, un processo che avrebbe richiesto molto più tempo utilizzando tecniche di mutagenesi del DNA standard, quali alanina scansione mutagenesi. Essa ha anche mostrato che questi peptidi corti Nef-derivati mantenuti la funzione biologica dei domini apoptotici nella proteina intera.
Dopo aver identificato un ruolo per Nef extracellulare, cioè l'apoptosi delle cellule T, abbiamo cercato una migliore comprensione di come Nef è stato secreto dalle cellule. Utilizzando una serie di costrutti Nef mutati, abbiamo mappato altamente conservate motivi proteine Nef nelle regioni N-terminali di entrambi HIV Nef, e il suo macaco Rhesus equivalente mac SIV (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, che sono fondamentali per exNef secrezione 13. Uno di questi motivi, la modifica Regione secrezione (SMR; 66VGFPV70), è stato particolarmente critico, come la sostituzione di alanina di uno dei suoi cinque aminoacidi sia notevolmente ridotto o abolito secrezione exNef. Quando consegnato alle cellule tramite del Soggetto attivo CHariot proteine reagenti di consegna, un peptide contenente la SMR attaccato ad una sequenza peptidica FLAG (SMRwt) è stato trovato per inibire la secrezione exNef sia da Nef transfettate e infezione da HIV cellule 18. Sulla base della nostra esperienza precedente con i peptidi, abbiamo deciso di utilizzare questo peptide per chiarire le molecole ei meccanismi alla base del ruolo della Nef SMR nella secrezione exNef.
Usando il peptide SMRwt come il nostro "proteina esca", abbiamo co-immunoprecipitata cellulari partner di legame degli SMR non infetti da lisati di cellule T 18. La sequenza del peptide FLAG disponibile una comoda maniglia per catturare il peptide SMRwt utilizzando anticorpi anti-FLAG resina di affinità. La nostra precedente scoperta che un singolo valina per alanina mutazione del peptide SMRwt era sufficiente per eliminare la sua inibizione della secrezione exNef identificato una comoda, peptide di controllo altamente specifico (SMRmut) che abbiamo usato per escludere le proteine co-immunoprecipitate non specifici per l'SMR. Utilizzando un peptide con la sdominio pecific di interesse piuttosto che la proteina full-length ci ha permesso di bypassare la proiezione di decine di fattori cellulari che si legano ad altri domini in Nef 19.
Una volta che abbiamo identificato i partner SMR vincolanti, un passo logico successivo è stato quello di dimostrare che i partner di legame cellulari individuati sono importanti per la funzione biologica 18. La procedura standard per farlo è a livelli proteici knockdown utilizzando miRNA proteina bersaglio-specifici o siRNA, e successivamente il dosaggio effetto sulla funzione biologica. Abbiamo effettuato miRNA smontabile, che inibisce traduzione del mRNA bersaglio, riducendo la produzione di tale obiettivo, in questo caso una proteina SMR-binding. Questa riduzione della proteina bersaglio è un effetto indiretto, e possibilmente ha un effetto ritardato sulla funzione biologica della proteina mirata svolge un ruolo pollici conseguenza, abbiamo anche impiegato la tecnica inibizione anticorpo meno comune per determinare se interrompere direttamente l'attività deila proteina bersaglio riduce o elimina la funzione biologica. In questa procedura, anticorpi contro la proteina mirati sono trasfettate nella cella usando Carro reagente, e interagire direttamente con la proteina bersaglio o sequestrare dal suo sito di funzione, o bloccando la sua rilevante dominio di legame. Inibizione della proteina bersaglio attraverso questa procedura interrompe direttamente la sua funzione, e può integrare procedure abbattibili RNA confermando ulteriormente l'importanza della proteina bersaglio per la funzione biologica.
Mentre Chariot reagente è efficace a fornire peptidi e proteine nelle cellule, questo processo richiede tempo e limita i tipi di esperimenti, ad esempio, esposizioni prolungate o ripetute e di studi su animali in vivo, che può essere eseguita. Di conseguenza, abbiamo aggiunto un peptide (CPP) sequenza di celle-penetrante al SMRwt peptide (SMRwt-CPP) 18 per generare un peptide che potrebbe essere assorbita dalle cellule passivamentedai mezzi di coltura. Questa versione è risultato efficace quanto il primo a secrezione exNef inibizione.
L'evidenza da questi esperimenti pubblicati dimostra la capacità di piccoli peptidi contenenti specifici motivi funzionali di antagonizzare la funzione della proteina intera per inibizione competitiva, e per isolare le proteine che legano questi motivi. Ci si aspetterebbe che queste tecniche dovrebbero essere utili in molti protocolli sperimentali. Essi dovrebbero anche essere efficace in ingegneria nuovi inibitori peptidici di molti processi cellulari, una funzione che può essere ulteriormente migliorato legame a sequenze CPP.
Protocol
Representative Results
Discussion
La comprensione dei meccanismi alla base della capacità di Nef di manipolare il percorso traffico exosomal sarà utile in nuovi inibitori di ingegneria di secrezione exNef. L'inibizione della secrezione exNef dovrebbe diminuire la deplezione delle cellule T CD4 e della CIA che guidano l'HIV / AIDS patogenesi. Verso questo obiettivo, abbiamo sviluppato una serie di nuovi reagenti e delle metodologie che ci ha permesso di analizzare la genetica di secrezione exNef, e cominciamo a determinare le proteine cel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance finanziamenti GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA concessione F31AI091484, Emory CFAR concessione P30 A1050409. Questa indagine è stata condotta in una struttura costruita con il supporto di strutture di ricerca di miglioramento di Grant # C06 RR18386 dal NIH / NCRR. Le cellule Jurkat, l'insieme di 20 HIV-1 Nef peptidi, così come il coniglio anti-HIV-1 Nef antisiero sono stati ottenuti dal NIH AIDS Research & Programma reagente di riferimento, (Rockville, MD).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
Riferimenti
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