Peptid-baserad identifiering av funktionella motiv och deras bindningspartners
Summary
Tekniker för att dissekera mekanismerna bakom utsöndringen av HIV-1 Nef i exosomes beskrivs. Specifika korta peptider härledda från Nef och protein transfektion utnyttjades för att bestämma struktur, funktion och bindande partner Nef utsöndring Modification Region. Dessa förfaranden har allmän relevans i många mekanistiska studier.
Abstract
Specifika korta peptider härledda från motiv som finns i hellånga proteiner, i vårt fall HIV-1 Nef, inte bara behålla sin biologiska funktion, men kan även kompetitivt hämma funktionen hos fullängdsproteinet. En uppsättning av 20 Nef scanning peptider, 20 aminosyror i längd med varje överlappande 10 aminosyror av dess granne, användes för att identifiera motiven i Nef ansvarig för dess induktion av apoptos. Peptider innehållande dessa apoptotiska motiv inducerade apoptos på nivåer jämförbara med den fullängds Nef protein. En andra peptid, som härrör från Sekretion Modification regionen (SMR) av Nef, bibehöll förmågan att interagera med cellulära proteiner som är involverade i Nef s sekretion i exosomes (exNef). Denna SMRwt peptid användes som "bete" protein i co-immunoprecipitation experiment för att isolera cellulära proteiner som binder specifikt till Nef s SMR motiv. Protein transfektion och antikropp hämning användes för att fysiskt störa interaktionen satsninglan Nef och mortalin, en av de isolerade SMR-bindande proteiner, och effekten mättes med en fluorescent-baserad exNef sekretion analys. Den SMRwt peptiden förmåga att konkurrera fullängds Nef för cellulära proteiner som binder SMR motiv, gör den till den första hämmare av exNef sekretion. Således, genom att använda de tekniker som beskrivs här, som utnyttjar de unika egenskaperna hos specifika korta peptider härledda från motiv som finns i hellånga proteiner kan man påskynda identifiering av funktionella motiv i proteiner och utvecklingen av peptidbaserade inhibitorer av patogena funktioner.
Introduction
Med tillkomsten av antiretroviral behandling har aidsepidemin i västvärlden har avtagit, men inte begränsas, och spridningen av hiv fortsätter att vara ett stort hälsoproblem börda över hela världen. Med undantag av den marginellt effektiva RV144 Thai rättegång, har HIV-vaccin hittills visat underlåtenhet att skydda mot infektion. Således är forskning om ytterligare potentiella terapeutiska mål fortfarande motiverad.
Tillsammans med CD4 T-cell utarmning, är ihållande generaliserad immun aktivering en kännemärke av HIV-infektion. Detta kronisk immun aktivering (CIA) leder till ökning i cell omsättning, aktiverade och differentierade lymfocytära subpopulationer, cellulär utmattning och åldrande, och dödandet av T-celler och B-celler via aktivering-inducerad celldöd (AICD) 1,2,3, och det är väl etablerad som en av de starkaste prediktorer för sjukdomsförloppet 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Men de mekanismer som ligger bakom CIA och CD4T-cells uttömning hos HIV-infektion förblir inte helt klarlagd.
Bevis från vårt labb och andra ledde oss till en modell för sjukdomsprogression (figur 1), där HIV-protein Nef (Negative Regulatory Factor) inducerar sin utsöndring i exosomes från HIV-1-infekterade celler 13,14. Dessa Nef-innehållande exosomes (exNef) inducera apoptos i ett antal cellinjer inklusive oinfekterade CD4 T-celler 15,16. Alternativt, i monocyter / makrofager exNef förändrar genuttryck mönster, t.ex. cytokinexpression, och tycks framkalla ett tillstånd av ledig immun aktivering. Denna mängd bevis tyder på en viktig roll för exNef i CIA och CD4 T-cells uttömning.
Att förstå den bakomliggande mekanismen Nef förmåga att manipulera exosomal trafficking vägen kommer att vara användbara i inhibitorer engineering nya av exNef sekretion. Hämning av exNef sekretion bör minska CD4 T-cell utarmningoch CIA som driver hiv / aids patogenes.
För att samla bevis som ledde till att vår modell för hiv / aids sjukdomsprogression och efterföljande uppgifter som byggde på denna modell, har vi utvecklat ett antal nya reagens och metoder som tillät oss att analysera genetiken av exNef sekretion, och börjar bestämma cellulära proteiner inblandade. I det inledande arbetet, fann vi att Nef protein inducerar apoptos i åskådareffekter celler och frisätts extracellulärt från Nef-transfekterade och HIV-infekterade celler 15. Peptider härledda från SDF-1α (Stromal cell derived factor-1, med alternativ splitsning alfa) hade tidigare visat att behålla mycket av bindningen och signaleringsaktivitet av full-längd molekyl 17. Vi spekulerade att peptider av Nef kan behålla en del av den apoptotiska aktiviteten hos det fullständiga proteinet, och att dessa peptider skulle nödvändigtvis behöver innehålla Nef apoptotiska domän (er). Att identifiera dessa peptider, och följaktligen Nefapoptotiska domän (er), erhöll vi en uppsättning av 20 HIV-1 Nef scanning peptider från NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Dessa 20-aa peptider, vardera överlappande 10 aminosyror av sin granne, som namnges av antalet sitt sista aminosyran, dvs N20 spänner Nef aminosyrorna 1-20, N30 spänner Nef aminosyrorna 11-30, etc 16. Vi fann att exponera T-celler extracellulärt till specifika peptider överlappar två distinkta 10-aa domäner i fullängd Nef protein inducerad apoptos i dessa celler. Efterföljande analys av dessa Nef-härledda apoptotiska peptider avslöjade deras förmåga att fysiskt interagera med kemokinreceptorn CXCR4 på ytan av T-celler, med bindningskinetik som tillät dessa peptider för att kompetitivt inhibera bindning mellan CXCR4 och dess naturliga ligand SDF-1α. Slutligen var Nef-härledda apoptotiska peptider interaktion med CXCR4 fann att inducera en stressreaktion i dessa T-celler vilket leder till apoptos. Denna bevisning tillät oss att quicKLY karta Nef funktionella domäner, en process som skulle ha tagit mycket längre tid med vanliga DNA mutagena tekniker såsom alaninscanning mutagenes. Den visade också att dessa korta Nef-härledda peptider behöll den biologiska funktionen hos de apoptotiska domäner i full längd protein.
Efter att ha identifierat en roll för extracellulär Nef, dvs apoptos av T-celler, sökte vi en bättre förståelse för hur Nef utsöndrades från cellerna. Med hjälp av en serie av muterade Nef konstruktioner, vi kartlagt högkonserverade motiv Nef protein i N-terminala regionerna av både HIV Nef, och dess Rhesusapa motsvarighet SIV mac (Simian immunbristvirus) Nef, som är avgörande för exNef sekretion 13. Ett av dessa motiv, utsöndringen Modification Region (SMR, 66VGFPV70), var särskilt kritisk, eftersom alanin ersättning av någon av sina fem aminosyror antingen kraftigt minskas eller avskaffas exNef sekretion. När levereras till celler via Active Motif s Chariot Protein Delivery Reagent, en peptid innehållande SMR fäst till en FLAG peptidsekvens (SMRwt) har visat sig hämma exNef sekretion från både Nef-transfekterade och HIV-infekterade celler 18. Utifrån våra tidigare erfarenheter med peptider, beslutade vi att använda denna peptid för att belysa de molekyler och mekanismer som ligger bakom Nef SMR: s roll i exNef sekretion.
Använda SMRwt peptid som vår "bete protein", vi co-immunprecipiterade cellulära bindande partner till SMR från icke-infekterade T-cellysat 18. FLAG peptidsekvensen förutsatt ett bekvämt handtag för att fånga SMRwt peptiden med användning av anti-FLAG affinitetsharts. Vår tidigare upptäckt att en enda valin till alanin mutation i SMRwt peptiden var tillräckligt för att avskaffa dess hämning av exNef sekretion identifierat ett bekvämt, mycket specifik kontroll peptid (SMRmut) som vi använde för att utesluta co-immunoutfällda proteiner inte specifika för SMR. Med hjälp av en peptid med specifika området av intresse snarare än fullängdsproteinet tillät oss att kringgå screening av dussintals cellulära faktorer som binder till andra domäner i Nef 19.
När vi identifierat de SMR-bindande partners, ett logiskt nästa steg var att visa att de identifierade cellulära bindande samarbetspartners är viktiga för den biologiska funktionen 18. Standardproceduren för att åstadkomma detta är att nivåer knockdown protein med användning målprotein-specifik miRNA eller siRNA, och därefter analysera effekten på den biologiska funktionen. Vi utförde miRNA knockdown, som hämmar translation av mål-mRNA, vilket minskar produktionen av det målet, i detta fall en SMR-bindande protein. Denna minskning av målproteinet är en indirekt effekt, och eventuellt har en fördröjd effekt på den biologiska funktionen av riktade protein spelar en roll i. Därför använde vi också mindre vanlig teknik antikropp inhibition för att avgöra om direkt störa aktiviteten hosmålproteinet reducerar eller eliminerar den biologiska funktionen. I detta förfarande, höjde antikroppar mot det riktade proteinet transfekteras in i cellen med Chariot Reagens och interagera direkt med målproteinet antingen binda den från dess plats av funktion, eller blockera dess aktuella domänen. Hämning av målproteinet genom detta förfarande stör direkt dess funktion, och kan komplettera RNA knockdown förfaranden genom ytterligare bekräftar vikten av målproteinet till den biologiska funktionen.
Medan Chariot Reagens är effektiv på att leverera peptider och proteiner i celler, denna process är tidskrävande och begränsar vilka typer av experiment, t.ex. långvarig eller upprepad exponering och in vivo djurstudier som kan utföras. Följaktligen lade vi en cell-penetrerande peptid (CPP) sekvens till SMRwt peptiden (SMRwt-CPP) 18 för att generera en peptid som kunde tas upp av celler passivtfrån odlingsmediet. Denna version var lika effektivt som det tidigare på att hämma exNef sekretion.
Bevisen från dessa publicerade experiment visar förmågan hos små peptider innehållande specifika funktionella motiv för att motverka funktion fullängdsproteinet genom kompetitiv hämning, och för att isolera de proteiner som binder dessa motiv. Man skulle förvänta sig att dessa tekniker ska vara användbart i många experimentella protokoll. De bör också vara effektiva i peptid engineering nya hämmare av många cellulära processer, en funktion som kan förbättras ytterligare genom koppling till CPP sekvenser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att förstå den bakomliggande mekanismen Nef förmåga att manipulera exosomal trafficking vägen kommer att vara användbara i inhibitorer engineering nya av exNef sekretion. Hämning av exNef sekretion bör minska CD4 T-cells uttömning och CIA som driver hiv / aids patogenes. Mot detta mål, har vi utvecklat ett antal nya reagens och metoder som tillät oss att analysera genetiken av exNef sekretion, och börjar bestämma de cellulära inblandade proteinerna. Detta synsätt ledde också till utvecklingen av den för…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance finansiering bidrag GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA bidrag F31AI091484, Emory CFAR bidrag P30 A1050409. Denna undersökning genomfördes i en anläggning konstruerad med stöd från forskningsanläggningar Förbättring Grant # C06 RR18386 från NIH / NCRR. De Jurkatceller, den uppsättning av 20 HIV-1 Nef peptider, liksom kanin anti-HIV-1 Nef antiserum erhölls från NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, (Rockville, MD).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
Riferimenti
- Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen?. Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
- Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
- Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
- Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
- Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
- Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. -. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
- Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
- Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef’s interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
- Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
- Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).
