العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em> thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em> بذور
Summary
ونحن التقرير وسيلة فعالة وبسيطة لعزل الأجنة في المراحل الأولى من التطوير من<em> thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em> البذور. ما يصل الى 40 الأجنة يمكن أن تكون معزولة في 1 ساعة إلى 4 ساعات، اعتمادا على تطبيق المصب. هذا الإجراء هو مناسبة لTranscriptome على، الحامض النووي، مراسل التعبير الجيني، المناعية ومضان<em> في الموقع</em> تحليلات التهجين.
Abstract
في النباتات المزهرة، الجنين يتطور داخل الأنسجة مغذية – السويداء – محاطة integuments البذور الأمهات (أو معطف البذور). ونتيجة لذلك، وعزل الأجنة النباتية في المراحل المبكرة (1 الخلية إلى مرحلة كروي) يمثل تحديا تقنيا بسبب عدم إمكانية الوصول النسبية. هو ضعف كفاءة تشريح دليل في المراحل الأولى بقوة من قبل صغر حجم بذور نبات الأرابيدوبسيس الشباب والإلتصاق من الجنين إلى الأنسجة المحيطة بها. هنا، نحن تصف طريقة التي تسمح للعزلة كفاءة الأجنة نبات الأرابيدوبسيس الشباب، مما أسفر حتى 40 الأجنة في 1 ساعة إلى 4 ساعات، اعتمادا على تطبيق المصب. يتم الإفراج الأجنة في عازلة العزلة عن طريق سحق البذور قليلا 250-750 مع مدقة البلاستيك في أنبوب إيبندورف. كوب microcapillary تعلق إما مختبر ماصة القياسية (عن طريق أنبوب المطاط) أو يتم استخدام microinjector التحكم هيدروليكيا لجمع الأجنة من مكان قطراتد على شريحة متعددة أيضا على ضوء المجهر المقلوب. المهارات الفنية المطلوبة هي بسيطة وقابلة للنقل بسهولة، والإعداد الأساسية لا تتطلب معدات مكلفة. الأجنة التي تم جمعها هي مناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب مثل RT-PCR، RNA تسلسل، تحليلات الحامض النووي، مضان التهجين في الموقع (FISH) في، المناعية، ومراسل المقايسات الجينات.
Introduction
ويحيط الجنين من النباتات المزهرة من السويداء، والأنسجة الغذائية المستمدة من حدث الإخصاب الثانية. ويحيط كل من الجنين والسويداء من قبل عدة طبقات الخلية من معطف البذور. هذه الأنسجة بشكل جماعي تشكيل البذور، التي تنمو داخل الفاكهة. وبالتالي، يعانون من ضعف الأنسجة وتحليلات خلية محددة من الأجنة نبات الأرابيدوبسيس بشدة بسبب عدم إمكانية الوصول لها. ومع ذلك، الأجنة في المراحل المتأخرة كروي أو في وقت لاحق نسبيا قابلة جيدا لتشريح اليدوي باستخدام الإبر التنغستن غرامة بموجب stereomicroscope، أو عن طريق تطبيق ضغط طفيف على البذور باستخدام ملقط لاستخراجها. واستخدمت هذه التقنيات بنجاح لTranscriptome على تحليلات أو التنميط epigenome مثل تهجين ميكروأري، التسلسل بيسلفيت، أو الحمض النووي الريبي التسلسل (على سبيل المثال 1-3). في المقابل، دراسات الأجنة في البيضة الملقحة إلى مرحلة كروية في وقت مبكر تظل تحديا تقنيا. حتى الآن، سوى عدد قليل من الدراسات لديهم معدل تقييمتحليلات Transcriptome على orted على الأجنة الشباب باستخدام إما تسليخ مجهري التقاط الليزر (LCM) من الأنسجة الجنينية من أقسام البذور ثابت 4 أو استخراج دليل من الأجنة الفردية من داخل البذور باستخدام أدوات غرامة 5. ومع ذلك، معدات LCM لا تتوفر عادة واستخراج الجنين دليل في مراحل مبكرة وقتا طويلا وتتطلب مهارات تشريح الممتازة التي هي غير قابلة للتحويل بسهولة. بالإضافة إلى تحليل الجينوم واسعة، الموقع التحليلات التعبير الجيني في هي أيضا من الصعب تنفيذها على الشباب والأجنة كله يشن من نبات الأرابيدوبسيس. إلى حد ما، يمكن الإفراج الأجنة الشباب على شرائح المجهر من قبل ضغط لطيف على البذور واستخدامها لمراسل المقايسات الجين أو البروتين عن طريق الكشف المناعية (انظر على سبيل المثال 6،7). هذا الأسلوب، ومع ذلك، لا يسمح العزلة الجنين عالية الإنتاجية، مما يعيق التحليل الكمي.
لذلك، قمنا بتطوير بروتوكول فعالة وسريعةلعزل الجنين في وقت مبكر من بذور نبات الأرابيدوبسيس التي هي بسيطة لإعداد، للتحويل بسهولة، ومناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب. المبدأ الأساسي هو سحق بلطف البذور – تشريح من siliques الشباب في أنبوب إيبندورف باستخدام مدقة البلاستيك في وجود مخزن مؤقت العزلة المناسبة. يتم وضع استخراج البذور في قطرات على شريحة متعددة بشكل جيد ويتم فحص لوجود الأجنة صدر في مرحلة المطلوب باستخدام مجهر مقلوب. يتم جمع الأجنة باستخدام الزجاج microcapillary تعلق على microinjector أو ماصة المختبر القياسية. لتطبيقات الجزيئية، يتم غسلها مرتين من قبل الأجنة الإفراج المتكررة إلى قطرات من العازلة العزلة جديدة قبل نقلهم إلى المخزن المؤقت الوجهة في حجم الحد الأدنى. للتطبيقات الخلوي (المقايسات مراسل، المناعية، FISH)، يمكن حذف غسل الخطوات.
الأسلوب يوفر العديد من المزايا: (ط) لأنها تعود 25-40 الأجنة في ~ 45 دقيقة عن التطبيق الخلويlications أو في 3-4 ساعة لتطبيقات الجزيئية (بما في ذلك الخطوات الغسيل)، (الثاني) أنها تتيح العزلة من المراحل الجنينية محددة، (الثالث) فمن السهل نقلها إلى الأشخاص ومختبرات أخرى بسبب الإعداد لها بسيطة، (الرابع) أنه يتطلب معدات متناول الإعداد الأساسية والتي هي قابلة للترقيات، و(V) قد تم استخدامه بنجاح لمختلف التطبيقات المصب مثل RNA تسلسل 8، تحليل الجينات المحددة DNA-مثيلة 9، المقايسات مراسل (10 و Raissig وآخرون، في الإعدادية.)، والأسماك (J. Jaenisch، U. Grossniklaus، C. Baroux غير منشورة، انظر الشكل 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
وضعنا بروتوكولا العزلة الجنين الذي هو سريع، فعال، ويمكن نقلها بسهولة إلى مختبرات أخرى.
المعدات وصفها هنا يتكون من مجهر مقلوب، وهو مياداة مجهرية، زجاج microcapillaries، مجتذب خيوط الرأسي وmicroinjector (الشكل 3A). الإعداد هو مماثلة لتل?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر تل ناوي ومارتن باير لنصائحهم على العزلة الجنين. MTR، VG، UG وCB ابتكر أجهزة العزلة الجنين. وضعت MTR، VG وCB بروتوكول العزلة الجنين. أنشئت MTR، VG وCB البروتوكول، عزل الأجنة، والجنين ولدت [كدنا]، ينجز VG على JJ PCR، MTR تلطيخ المكتب المركزي للاحصاءات، والتجارب على الأسماك. MTR، VG، CG وUG كتب مخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة زيوريخ، وزمالة من مؤسسة أبحاث روش (لMTR)، والمنح المقدمة من المؤسسة السويسرية الوطنية (لUG وCB).
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
Riferimenti
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), (1111).
