Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo's van<em> Arabidopsis thaliana</em> Zaden
Summary
Wij rapporteren een efficiënte en eenvoudige methode om embryo's te isoleren in een vroeg stadium van de ontwikkeling van<em> Arabidopsis thaliana</em> Zaden. Tot 40 embryo's kunnen worden afgezonderd 1 uur tot 4 uur, afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing. De procedure is geschikt voor transcriptome, DNA-methylatie, reporter genexpressie, immunostaining en fluorescentie<em> In situ</em> Hybridisatie analyses.
Abstract
In bloeiende planten, het embryo zich ontwikkelt binnen een voedende weefsel – het endosperm – omringd door de moederlijke zaad integumenten (of zaadhuid). Als gevolg daarvan, is de isolatie van de plant embryo's in een vroeg stadium (1 cel tot bolvormige stadium) technisch uitdagende vanwege hun relatieve ontoegankelijkheid. Efficiënte handmatige dissectie in de aanloopfase wordt sterk belemmerd door de kleine omvang van jonge Arabidopsis zaden en de kleverigheid van het embryo aan het omringende weefsel. Hier beschrijven we een werkwijze die de efficiënte isolatie van jonge Arabidopsis embryo maakt, bevatten tot 40 embryo's in 1 uur tot 4 uur, afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing. Embryo's worden uitgebracht in een isolement buffer met iets breken 250-750 zaden met een plastic stamper in een Eppendorf buis. Een glazen microcapillaire bevestigd aan ofwel een standaard laboratorium pipet (via een rubberen buis) of een hydraulisch gestuurde microinjector wordt gebruikt om embryo's te verzamelen van druppeltjes plaatsd op een multi-well slide op een omgekeerde lichtmicroscoop. De technische vaardigheden die nodig zijn eenvoudig en gemakkelijk overdraagbaar, en de basis-setup is dure apparatuur nodig. Verzamelde embryo's zijn geschikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals RT-PCR, RNA sequentie, DNA methylatie analyse, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), immunokleuring en reporter assays.
Introduction
De embryo van bloeiende planten wordt omgeven door het endosperm, een voedingsweefsel afgeleid van een tweede fertilisatiegebeurtenis. Zowel embryo en endosperm zijn omgeven door verschillende cellagen van de zaadhuid. Gezamenlijk vormen deze weefsels een zaad dat in de vrucht te ontwikkelen. Zo zijn weefsel-en cel-specifieke analyses van Arabidopsis embryo's sterk aangetast vanwege hun ontoegankelijkheid. Toch embryo's in de late-bolvormige of latere stadia zijn relatief goed vatbaar voor handmatige dissectie met behulp van fijne wolfraam naalden onder de stereomicroscoop, of door lichte druk op het zaad met behulp van een tang om ze te halen. Dergelijke technieken zijn met succes toegepast transcriptoom of epigenoom profilering analyses zoals microarray hybridisatie bisulfietsequencing of RNA sequentie (bijvoorbeeld 1-3). In tegenstelling, studies van embryo's in de zygote tot begin bolvormige stadium blijven technisch uitdagend. Tot op heden slechts een paar studies hebben reported transcriptoomanalyses op jonge embryo's met behulp van laser-capture microdissectie (LCM) van embryonale weefsels van vaste zaad hoofdstukken 4 of manuele extractie van individuele embryo vanuit zaden met behulp van fijne instrumenten 5. Echter, LCM apparatuur niet algemeen beschikbaar en handmatige extractie embryo in een vroeg stadium is tijdrovend en vereist uitstekende dissectie vaardigheden die niet makkelijk overdraagbaar. Naast genoom-brede analyses, in situ genexpressie analyses zijn ook moeilijk te voeren op jonge hele-mount embryo van Arabidopsis. Tot op zekere hoogte kunnen jonge embryo op objectglaasjes worden vrijgegeven door lichte druk op de zaden en gebruikt voor reporter assays of proteindetectie door immunokleuring (zie bijvoorbeeld 6,7). Deze techniek is echter niet mogelijk high-throughput embryo isolatie, waardoor kwantitatieve analyse belemmeren.
Daarom is een efficiënt en snel ontwikkeld protocolvoor vroege embryo isolatie van Arabidopsis zaden die is eenvoudig op te zetten, gemakkelijk overdraagbaar, en geschikt voor een verscheidenheid van downstream toepassingen. Het basisprincipe is om voorzichtig te verpletteren zaden – ontleed van jonge siliques in een Eppendorf buisje met een plastic stamper in een geschikte isolatie buffer. Het extract wordt in druppels op een multi-well glijbaan en gescreend op de aanwezigheid van vrijgekomen embryo's in de gewenste fase met behulp van een omgekeerde microscoop. Embryo's worden verzameld met behulp van een glazen microcapillaire bevestigd aan een microinjector of een standaard laboratorium pipet. Voor moleculaire toepassingen, worden embryo's tweemaal gewassen door herhaalde introductie in druppels van nieuwe isolatie buffer voor het overzetten naar de bestemming buffer in een minimaal volume. Voor cytologische toepassingen (reporter assays, immunokleuring, FISH), kunnen wasstappen worden weggelaten.
De methode biedt verschillende voordelen: (i) het levert 25-40 embryo ~ 45 min voor cytologische appcaties of 3-4 uur gedurende moleculaire toepassingen (waaronder de wasstappen), (ii) het mogelijk isoleren van specifieke embryonale stadia, (iii) het kan gemakkelijk worden overgedragen aan andere personen laboratoria vanwege de eenvoudige installatie, (iv) vereist betaalbaar Voorzieningen voor basale configuratie die vatbaar is voor upgrades, en (v) werd met succes gebruikt voor verschillende stroomafwaartse toepassingen zoals RNA sequencing 8, genspecifieke DNA-methylatie analyse 9 reporter assays (10 en Raissig et al.., in prep.) en VIS (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux ongepubliceerde, zie figuur 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
We ontwikkelden een embryo isolatieprotocol dat snel doeltreffende en kan gemakkelijk worden overgedragen naar andere laboratoria.
De hier beschreven apparatuur bestaat uit een omgekeerde microscoop, een micromanipulator, glas microcapillairen, een verticale gloeidraad trekker en een microinjector (figuur 3A). De opstelling is vergelijkbaar met die beschreven voor de enkele dierlijke cel isolement transcriptomics analyses 17. We hebben ook met succes gewerkt met e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij willen graag Tal Nawy en Martin Bayer bedanken voor hun advies over embryo isolement. MTR, VG, UG en CB bedacht het embryo isolatie materiaal. MTR, VG en CB ontwikkelde het embryo isolatie protocol. MTR, VG en CB gevestigde het protocol, die de embryo's, en de gegenereerde embryo cDNA, VG deed de PCR, MTR de GUS kleuring, JJ de FISH experimenten. MTR, VG, CG en UG schreef het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door de Universiteit van Zürich, een Fellowship van de Roche Research Foundation (MTR), en subsidies van de Zwitserse Nationale Stichting (tot UG en CB).
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
Riferimenti
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), (1111).
