Effektiv och snabb isolering av tidigt stadium embryon från<em> Arabidopsis thaliana</em> Frön
Summary
Vi rapporterar en effektiv och enkel metod för att isolera embryon i tidiga stadier av utveckling från<em> Arabidopsis thaliana</em> Frön. Upp till 40 embryon kan isoleras i 1 timme till 4 timmar, beroende på nedströms ansökan. Förfarandet är lämpligt för transkriptom, DNA-metylering, reportergenuttryckning, immunofärgning och fluorescens<em> In situ</em> Hybridiseringsanalyser.
Abstract
I blommande växter, utvecklar embryot inuti en närande vävnad – endospermen – omgiven av moderns frö integuments (eller fröskal). Som en följd av detta, är isoleringen av växtembryon i tidiga skeden (1 cell till klotformiga stadiet) utmanande tekniskt på grund av deras relativa otillgänglighet. Effektiv manuell dissektion i tidiga skeden är starkt försämras av den lilla storleken av unga Arabidopsis frön och vidhäftning av embryot till de omgivande vävnaderna. Här beskriver vi en metod som möjliggör en effektiv isolering av unga Arabidopsis embryon, vilket ger upp till 40 embryon i 1 h till 4 h, beroende på nedströms tillämpning. Embryon släpps in i isolering buffert genom något krossning 250-750 frön med en plast mortelstöt i ett Eppendorf-rör. Ett glas microcapillary anslutning till antingen en standard laboratorium pipett (via en gummislang) eller en hydrauliskt styrd microinjector används för att samla in embryon från dropparna platsd på en multi-väl glida på ett inverterat ljusmikroskop. De tekniska kunskaper som krävs är enkla och lätta att överföra, och den grundläggande installationen inte kräver dyr utrustning. Insamlade embryon är lämpliga för en mängd olika efterföljande tillämpningar såsom RT-PCR, RNA-sekvensering, DNA-analyser metylering, fluorescens in situ hybridisering (FISH), immunfärgning, och reporter analyser gen.
Introduction
Embryot av blommande växter är omgiven av frövitan, en närande vävnad som härrör från en andra befruktning händelse. Både embryo och frövitan är omgivna av flera cellager av fröskalet. Kollektivt dessa vävnader bildar ett frö, som utvecklas inuti frukten. Således är vävnads-och cell-specifika analyser av Arabidopsis embryon kraftigt nedsatt på grund av sin otillgänglighet. Ändå embryon vid de sena-klotformiga eller senare stadier är relativt väl lämpade för manuell dissektion med fina volfram nålar under stereomikroskop, eller genom ett lätt tryck på fröet med pincett för att utvinna dem. Sådana tekniker har framgångsrikt använts för transcriptome eller epigenomet analyser profilering såsom microarray hybridisering, bisulfit sekvensering, eller RNA-sekvensering (t.ex. 1-3). Däremot studier av embryon vid zygot till tidigt klotformiga stadium förblir tekniskt utmanande. Hittills endast ett fåtal studier har reported transkriptom analyser på unga embryon med hjälp av antingen laser-capture microdissection (LCM) i embryonala vävnader från fasta utsäde avsnitt 4 eller manuell utvinning av enskilda embryon från inom frön med fina verktyg 5. Dock är LCM utrustningen inte är allmänt tillgänglig och manuell embryo utvinning i tidiga skeden är tidskrävande och kräver utmärkta dissektion färdigheter som inte är lätt överförbara. Förutom heltäckande genomanalyser, in situ analyser genuttryck är också svåra att utföra på unga, hel-mount embryon av Arabidopsis. Till viss del kan unga embryon släppas på objektglas med ett lätt tryck på fröna och används för analyser reporter gen eller protein upptäckt genom immunfärgning (t.ex. se 6,7). Denna teknik, dock inte tillåter hög genomströmning embryo isolering, vilket hindrar kvantitativa analyser.
Därför har vi utvecklat en effektiv och snabb protokollför tidiga embryot isolering från Arabidopsis frön som är enkel att installera, lätt att överföra, och lämpar sig för en mängd olika tillämpningar i efterföljande led. Den grundläggande principen är att försiktigt krossa frön – dissekeras från unga siliques i ett Eppendorf-rör med en plast mortelstöt i en lämplig isolering buffert. Fröet extraktet placeras i droppar på en med flera brunnar rutschbana och screenas med avseende på närvaro av frisatta embryon vid det önskade stadiet med ett inverterat mikroskop. Embryon samlas in med hjälp av ett glas microcapillary bifogas en microinjector eller en standard laboratorium pipett. För molekylära tillämpningar, är embryon tvättas två gånger genom upprepad utsättning droppar av ny isolering buffert innan du överför dem till destinationen buffert i en minimal volym. För cytologiska applikationer (reporter analyser, immunfärgning, fisk), kan tvättningsstegen utelämnas.
Metoden erbjuder flera fördelar: (i) den ger 25-40 embryon i ~ 45 min för cytologisk apptioner eller i 3-4 tim för molekylära ansökningar (inklusive tvättningsstegen), (ii) det tillåter isolering av specifika embryonala stadier, (III) är det lätt att överföra till andra personer och laboratorier på grund av dess enkla installation, (iv) det kräver prisvärd utrustning för den grundläggande installationen som är mottaglig för uppgraderingar, och (v) att det var framgångsrikt använts för olika nedströms applikationer såsom RNA-sekvensering 8, gen-specifika DNA-metylering analys 9, analyser reporter (10 och Raissig et al., i prep.) och fisk (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux opublicerade, se Figur 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utvecklade ett protokoll embryo isolering som är snabb, effektiv, och kan lätt överföras till andra laboratorier.
Den utrustning som beskrivs här består av ett inverterat mikroskop, en mikromanipulator, glas mikrokapillärer, en vertikal glödtråd avdragare och en microinjector (Figur 3A). Upplägget liknar det som beskrivits för enstaka djur cellisolering för transkriptomik analyser 17. Vi har också framgångsrikt arbetat med en mer grundläggande in…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Tal Nawy och Martin Bayer för deras råd om Embrvoisolering. MTR, VG, UG och CB utarbetat utrustningen Embrvoisolering. MTR, VG och CB utvecklade protokollet Embrvoisolering. MTR, VG och CB etablerade protokoll, isolerade embryon, och genererade embryo cDNA, som utförs VG PCR, MTR GUS färgning, JJ FISH experiment. MTR, VG, CG och UG skrev manus. Detta arbete har finansierats av University of Zürich, en gemenskap av Roche Research Foundation (till MTR), och bidrag från den schweiziska National Foundation (till UG och CB).
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies |
Riferimenti
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), (1111).
