El aislamiento de los microorganismos del suelo nativo con potencial para romper biodegradables Mantillo películas de plástico utilizados en la agricultura

Summary

Las películas de plástico con la etiqueta "biodegradable" están disponibles comercialmente para uso agrícola como coberturas. Labranza representa un método de tratamiento atractiva, pero la degradación en condiciones de campo es poco conocida. El propósito de este estudio fue desarrollar métodos para el aislamiento de hongos del suelo nativo y las bacterias que colonizan las películas de mantillo de plástico después del entierro de campo.

Abstract

Los hongos nativos en los suelos agrícolas que colonizaron películas mantillo biodegradables disponibles comercialmente (BDM), se aislaron y evaluaron de potencial de degradar plásticos. Típicamente, cuando se conocen formulaciones de plásticos y una fuente de la materia prima está disponible, de plástico en polvo puede ser suspendido en los medios de comunicación y la degradación basados ​​en agar determinados por la visualización de las zonas de compensación. Sin embargo, este enfoque mal imita en la degradación in situ de BDM. En primer lugar, BDM no se dispersan en forma de partículas pequeñas en toda la matriz del suelo. En segundo lugar, BDM no se venden comercialmente como polímeros puros, sino más bien como las películas que contienen aditivos (por ejemplo, cargas, plastificantes y colorantes) que pueden afectar el crecimiento microbiano. Los procedimientos descritos en este documento se utilizan para los aislamientos obtenidos de películas mantillo de enterramiento. Aislados fúngicos obtenidos de BDMs excavadas fueron probados individualmente para el crecimiento en pedazos de nuevos BDMs, desinfestadas establecidos sobre medio definido que no contiene fuente de carbono ealvo agar. Los aislados que crecían en BDMs fueron probados en medio líquido donde BDMs eran la única fuente de carbono adicional. Después de aproximadamente diez semanas colonización fúngica y la degradación de BDM se evaluaron por microscopía electrónica de barrido. Los aislados fueron identificados a través de análisis de secuencias de genes de ARN ribosomal. Este informe describe métodos para el aislamiento de hongos, pero las bacterias también se aisló usando estos métodos por los medios de sustitución apropiadas para las bacterias. Nuestra metodología puede ser muy útil para los estudios de investigación de desglose de las películas de plástico intactas o productos para los que las materias primas de plástico o bien son desconocidos o no están disponibles. Sin embargo, nuestro enfoque no proporciona un método cuantitativo para comparar las tasas de degradación de BDM.

Introduction

La degradación ha sido históricamente considerada un atributo deseable de polímeros plásticos, debido desglose reduce su vida útil y durabilidad del producto. Recientemente, la conciencia de los problemas ambientales presentados por los residuos de plástico en el entorno natural ^1,2,3 ha hecho plásticos biodegradables una alternativa atractiva a los materiales plásticos convencionales. Degradación (definida como los cambios estructurales, la fragmentación y la reducción en el peso molecular, la integridad, y la fuerza de ^4,5) se produce a través de una serie de eventos, incluyendo tanto los procesos abióticos (estrés térmico, la foto-oxidación, la hidrólisis, la erosión y el estrés mecánico), y la degradación biológica ^6. Si bien los procesos abióticos pueden cambiar el tamaño de los fragmentos y las características de los plásticos, se requieren los microorganismos para su último mineralización al agua y dióxido de carbono (en condiciones aeróbicas) y / o metano (en condiciones anaerobias).

Un nicho importante paraplásticos biodegradables existe en la agricultura, donde se utilizan coberturas de plástico para evitar el crecimiento de malezas, para retener la humedad del suelo y para aumentar la temperatura del suelo ^7,8. Cientos de miles de acres en los Estados Unidos solamente están cubiertas con mulch de plástico ^9, incluyendo coberturas compuestas de plástico biodegradable. Después de una temporada de crecimiento de los cultivos, las opciones para disponer de coberturas biodegradables (BDM) incluyen la eliminación en un vertedero, la incineración para recuperar energía ^10, la degradación a través de compostaje, o degradación en el suelo después de la siembra ^11. De éstos, el destino menos mano de obra intensiva está arando BDM en el suelo, pero sin la degradación eficiente y la mineralización durante meses no cultivadas (generalmente en el invierno), fragmentos de plástico podrían permanecer y interferir con los equipos agrícolas durante la labranza y la siembra de primavera, y persistir en el medio ambiente en el que impactan significativamente la fauna, la flora y microbiota ^1,2,3,10.

<p class = "jove_content"> Aunque muchos productos plásticos, incluyendo películas agrícolas, llevan la etiqueta de "biodegradable" o "compostables", en la práctica, la degradación y la mineralización pueden ser demasiado ineficiente y / o demasiado incompleta para la descomposición en el suelo a ser un alternativa viable para la eliminación de estos productos. Por ejemplo, polietilenos oxo-biodegradables lograrse sólo 12,4% de mineralización después de un año de la intemperie ya los tres meses posteriores en un 58 ° C de compost, y menos de la mitad de esa cantidad de mineralización tuvieron lugar cuando la temperatura de la composta era 25 ° C ^12. En el invierno, la temperatura del suelo en la mayoría de lugares serían más bajos que cualquiera de estas temperaturas, presumiblemente como resultado aún menor actividad microbiana y, en consecuencia, menor mineralización. Además de disminuir las tasas de degradación, el mal uso del término "biodegradable" ha llevado a desconfiar de estos productos por los consumidores ^13,14, incluidos los de la industria agrícola. La biodegradación es la conversiónde polímeros a dióxido de carbono (y / o metano) y agua ¹⁴ por microorganismos de origen natural ^4. Por lo tanto, la biodegradación se debe medir químicamente; la asociación física de microorganismos con un sustrato no implica la degradación microbiana de ese material.

Como parte de un esfuerzo para examinar el uso sostenible de BDM en la agricultura, este estudio se centra en el descubrimiento de los microorganismos nativos de suelos agrícolas que colonizan y degradan BDMs disponibles comercialmente. Métodos de ensayo normalizados se han publicado para medir químicamente la descomposición de los plásticos biodegradables mediante abióticos y biológicos ^15,16,17. Sin embargo, estos métodos no se refieren a la degradación de plásticos por especies microbianas individuales, o proporcionan métodos para su aislamiento. La metodología se asemeja más estrechamente en este documento métodos estándar diseñados para evaluar plásticos para la resistencia a la degradación microbiana después de la inoculación de las muestras con esporas de hongos18,19.

Cuando se conocen formulaciones de plásticos y una fuente de la materia prima es disponible, el plástico en polvo puede ser suspendido en los medios de comunicación y la degradación basados ​​en agar determinados por la visualización de zonas de compensación ^13. Este método se ha utilizado anteriormente para identificar microorganismos que degradan polímeros tales como poliuretano ^20, poli-(butileno succinato-co-adipato) ^21, y poli (ácido láctico) ^22. Un método similar implica la suspensión de plástico en polvo puro en un medio líquido, donde el plástico es la única fuente de carbono ^20,23. Si bien estos métodos tienen la ventaja de un sistema definido, que mal imitar en la degradación in situ de BDM. En primer lugar, el área de superficie se distribuye de manera diferente porque BDMs no se dispersan en partículas pequeñas en toda la matriz del suelo, sino más bien, venden y utilizan como películas. En segundo lugar, la composición química de BDM es diferentes de los polímeros puros. BDMs generalmente contienen aditivos tales comomateriales de relleno, plastificantes y colorantes, y estos aditivos pueden afectar el crecimiento microbiano y de ese modo, la tasa de mineralización. Por esta razón, y debido a la composición de ciertas películas comerciales en este estudio eran de propiedad, película de plástico en su forma de campo-listo se utilizó para aislar los hongos y las bacterias. Por simplicidad, los siguientes métodos se describen sólo para los hongos, con modificaciones observaron en su caso para aislamientos bacterianos.

En un estudio reciente ^24, tres BDMs comercialmente disponibles y una película experimental se utilizaron en los sitios agrícolas en tres diferentes regiones de los Estados Unidos durante un período de crecimiento, y posteriormente colocados en mallas (250 micras) bolsas y enterrados en un invierno en el suelo en los mismos sitios. Las aberturas de la malla de 250 micras permiten hifas del hongo penetre excluyendo raíces y la mayoría de la fauna del suelo, y reducir al mínimo la intrusión del suelo ^25,26. Materiales de nylon evitan la degradación de la bolsa en el suelo. Después de la excavación, fuNGAL aislamientos fueron recuperados a partir de piezas BDM y se evaluaron para el crecimiento en medio mínimo sin una fuente de carbono, excepto el agar y unos 5 cm x 5 cm cuadrados de superficie desinfestados de nuevo, película BDM no utilizada que fue pre-desinfestados. La mayoría de los plásticos que se utilizan como películas no pueden ser esterilizados en autoclave sin pérdida de integridad, se utiliza la luz ultravioleta para matar las células microbianas que residen en los plásticos. ISO ¹⁹ 846 recomienda superficie-desinfestación en 70% de etanol y posterior secado, pero si se utiliza este método, uno debe asegurarse de que ningún componente o aditivo de la película se ve afectada negativamente por el etanol. Desde BDMs presumiblemente se fabrican para soportar la luz del sol, UV fue elegido como un método de descontaminación.

Los aislados que crecían en BDM piezas mejor que en un medio mínimo solo se seleccionaron para su posterior estudio. Agar, un polisacárido producido por las algas marinas, se utiliza para solidificar medios microbianos, ya que no es utilizada típicamente metabólicamente por agrícolamente y médicamente nomicroorganismos capaces, sin embargo, agar enzimas que hidrolizan se han aislado a partir de bacterias marinas ²⁷ y agar que hidrolizan las bacterias también se han aislado de suelo ^28. Polímeros BDM y agar tanto se espera que sean sustratos raras para enzimas secretadas por hongos del suelo, que no se han desarrollado en ambientes que contienen estos polímeros como posibles fuentes de nutrientes, pero ambos sustratos están presentes en la placa de bioensayo descrito en este documento (Paso 7). Los hongos que utilizan BDMs pero no de agar como una fuente de carbono pueden ser diferenciados de los hongos que sólo utilizan agar, comparando el crecimiento en agar-medio solidificado que contiene i) fuente de carbono sin añadido excepto agar (control negativo), ii) BDM películas (experimental) y iii) la glucosa (control positivo). El crecimiento de todas las cepas se espera que en un medio mínimo más la glucosa; hongos no derivada de la glucosa que contienen placas puede no ser capaz de crecer en el medio mínimo particular usado en el experimento. Potential BDM degradadores debe crecer en agar solidificado medio mínimo + film BDM mejor que crecen en agar solidificado medio mínimo solo. Los hongos que crecen en placas de medio mínimo de agar-son degradadores o poblaciones de ecosistemas oligotróficos, y también se espera que crezcan en el agar asociado con películas BDM en placas de bioensayo, pero no en las propias películas (a menos que casualmente también degradan polímeros BDM).

Para eliminar la posibilidad de ver el crecimiento microbiano debido a la utilización de agar y no de BDM, seguimos nuestro ensayo inicial para la colonización BDM en placas de agar con un bioensayo en medio de caldo definido (Paso 9). BDM piezas representaban la fuente de carbono sólo se conoce en los tubos de ensayo biológico.

Después de la selección inicial, y después de la reactivación de las existencias de glicerol de las cepas aisladas, algunos formaron micelios escasa pero visible en medio definido líquido que no contiene fuente de carbono conocido. Estos resultados sugieren que algunos de los aislados fueron adquiridos oligotrophs – organismos que crecen por barrido de cantidades muy pequeñas de carbono, nitrógeno y otros nutrientes disueltos ya sea en el ambiente acuoso o que existe como volátiles en el aire ^29,30,31. La identificación de especies a través de análisis de ADN ribosómico 18S apoya este punto de vista, ya que muchos de los aislados emparejados géneros fúngicos se informó anteriormente para exponer oligotrofía ^32. Poblaciones de ecosistemas oligotróficos, que son comúnmente saprofitos, requieren una amplia gama de capacidades metabólicas para la utilización del sustrato en una gama de entornos de ^30. Por lo tanto, no es sorprendente que los mismos hongos que aislamos de la BDM (presumiblemente requieren capacidades enzimáticas inusuales) demostraron capacidades oligotróficos, y fueron capaces de crecer en trazas de contaminantes, tales como aceites de la piel de las huellas dactilares, el polvo o volátiles traza en el aire. Debido al aislamiento de poblaciones de ecosistemas oligotróficos, llegamos a la conclusión de que el crecimiento en una superficie BDM por sí solo no podría ser utilizado para inferir BDM avería. Los métodos descritos en este documento reflejan nuestros esfuerzos para screen colonizadores BDM nativas de suelos agrícolas bona fide desglose BDM.

Protocol

Este procedimiento requiere por lo menos varios meses para la incubación de las películas de BDM en el suelo, y varios meses más para bioensayos secuenciales tanto sobre placas de agar en caldo y agar-libre, definido químicamente para evaluar la colonización y la degradación. Métodos individuales se enumeran en el orden en que se realizarán. 1. La incubación de las películas BDM en suelo Incorporar películas BDM en el suelo en condiciones que imitan las …

Representative Results

En un estudio reciente 24, cuatro repeticiones cada uno de tres BDMs disponibles comercialmente etiquetados como "biodegradable", además de un cine experimental y un control convencional de plástico, fueron colocados sobre el suelo como abono orgánico para la producción de tomate en la primavera de 2010 en Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, y Lubbock, TX. En el otoño de 2010, las plazas de cine BDM fueron cortadas de cada resistido mulch en cuatro parcelas de reproducción, y el suelo nativo fue …

Discussion

El procedimiento descrito en este documento representa una técnica de primer paso para el aislamiento de microorganismos degradadores potenciales BDM del suelo, y se utilizó con éxito para aislar los hongos de BDM enterrados en el suelo durante siete meses. Los hongos crecieron cuando se inoculó sobre el material de BDM fresco del mismo tipo, lo que indica que los hongos aislados eran de hecho colonizadores, y que las películas no fueron inhibitorios para el crecimiento de hongos. Aislamiento de los hongos que degr…

Materials

Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents