Isolering av stedlige masser Mikroorganismer med potensial for å bryte ned biologisk nedbrytbar plast Mulch filmer som brukes i Landbruk

Summary

Plastfilm merket "nedbrytbart" er kommersielt tilgjengelig for bruk i landbruket som mulches. Jordbearbeiding representerer en attraktiv disponeringsmetode, men nedbrytning under feltforhold er dårlig forstått. Hensikten med denne studien var å utvikle metoder for å isolere innfødte jord sopp og bakterier som kolonisere plast mulch film etter felt begravelse.

Abstract

Sopp innfødte til jordbruksjord som koloniserte kommersielt tilgjengelige nedbrytbare mulch (BDM) filmer ble isolert og vurdert for potensielt å forringer plast. Vanligvis, når formuleringer av plast er kjent og en kilde for råmaterialet er tilgjengelig, kan pulverisert plast bli suspendert i agar-baserte media og nedbrytning bestemt ved visualisering av clearing soner. Men etterligner denne tilnærmingen dårlig in situ nedbrytning av bdms. Først blir bdms ikke spredt som små partikler i hele jord matrise. Dernest er bdms ikke selges kommersielt som rene polymerer, men heller som filmer som inneholder tilsetningsstoffer (f.eks fyllstoffer, myknere og fargestoffer) som kan påvirke mikrobiell vekst. Prosedyrene er beskrevet her ble brukt for isolater ervervet fra jord-begravet mulch filmer. Fungal isolater ervervet fra utgravde bdms ble testet individuelt for vekst på biter av nye, disinfested bdms lagt oppå definert medium som ikke inneholder karbon kilde except agar. Isolater som vokste på bdms ble ytterligere testet i flytende medium hvor bdms var den eneste ekstra karbonkilde. Etter omtrent ti uker ble det fungale kolonisering og BDM degradering vurdert ved scanning elektronmikroskopi. Isolatene ble identifisert via analyse av ribosom RNA gensekvenser. Denne rapporten beskriver metoder for sopp isolasjon, men bakterier også ble isolert ved hjelp av disse metodene ved å erstatte media som passer for bakterier. Vår metodikk bør være nyttig for studier som undersøker nedbryting av intakte plastfilm eller produkter som plast råstoff er enten ukjent eller ikke tilgjengelig. Men vår tilnærming ikke gir en kvantitativ metode for å sammenligne priser av BDM degradering.

Introduction

Degradering har historisk vært ansett som en uønsket egenskap av plast polymerer, fordi sammenbrudd forkorter produkt levetid og holdbarhet. Nylig har bevissthet om miljøproblemer som presenteres av plastavfall i naturen ^1,2,3 gjort biologisk nedbrytbar plast et attraktivt alternativ til konvensjonelle plastmaterialer. Nedbrytning (definert som strukturelle endringer, fragmentering og reduksjon i molekylvekt, integritet og styrke ^4,5) skjer via en serie av hendelser, inkludert både abiotiske prosesser (termisk stress, foto-oksidering, hydrolyse, erosjon og mekanisk stress), og biologisk nedbrytning ^seks. Mens ikke-biologiske prosesser kan endre fragment størrelse og egenskapene til plast, er mikroorganismer som kreves for deres endelige mineralisering til vann og karbondioksid (i aerobe betingelser) og / eller metan (under anaerobe betingelser).

En betydelig nisje forbiologisk nedbrytbar plast finnes i landbruket, der plast mulches brukes for å hindre ugress, for å beholde fuktigheten i jordsmonnet og øke jordtemperaturer ^7,8. Hundretusener av hektar i USA alene er dekket med plast mulches ^9, inkludert mulches består av biologisk nedbrytbar plast. Etter en avling vekstsesongen, alternativene for avhending av biologisk nedbrytbare mulches (bdms) inkluderer deponering, forbrenning med energigjenvinning ^10, degradering via kompostering eller redusert i jorda etter jordbearbeiding ^11. Av disse er det minst arbeidskrevende skjebne pløying bdms i jorden, men uten effektiv nedbrytning og mineralisering under non-crop måneder (vanligvis om vinteren), kan plast fragmenter gjenstår og forstyrre landbruksutstyr løpet av våren jordarbeiding og planting, og vedvare i miljøet der de betydelig innvirkning dyreliv, planteliv, og bakterieflora ^1,2,3,10.

<p class = "jove_content"> Selv om mange plast-produkter, blant annet jordbruks løvlag filmer, bære etiketten "bionedbrytbar" eller "komposterbar", i praksis, kan nedbrytning og mineralisering bli for lite effektive og / eller for ufullstendig for i jord-spaltning for å være en levedyktig alternativ for deponering av disse produktene. For eksempel oppnådde oxo-nedbrytbare polyetylenene bare 12,4% mineralisering etter ett år med forvitring og tre påfølgende måneder i en 58 ° C kompost, og mindre enn halvparten av dette beløpet av mineralisering skjedde da kompost temperaturen var 25 ° C ^12. Om vinteren ville jordtemperaturer på de fleste steder være lavere enn noen av disse temperaturene, antagelig resulterer i enda lavere mikrobiell aktivitet og dermed mindre mineralisering. I tillegg til å bremse Nedbrytingshastigheten, har misbruk av begrepet "biologisk nedbrytbare" førte til mistillit til disse produktene av forbrukere ^13,14, inkludert de i landbruksnæringen. Biologisk nedbrytning er konverteringav polymerer til karbondioksyd (og / eller metan) og vann ¹⁴ ved ^hjelp av naturlig forekommende mikroorganismer ^4.. Derfor må bionedbrytbarhet måles kjemisk, fysisk assosiasjon av mikroorganismer med et substrat innebærer ikke mikrobiell nedbrytning av det materialet.

Som en del av et forsøk på å undersøke bærekraftig bruk av bdms i landbruket, denne studien fokusert på å oppdage mikroorganismer som hører hjemme i jordbruksjord som kolonisere og fornedre kommersielt tilgjengelige bdms. Standard testmetoder har blitt publisert for kjemisk måling nedbryting av biologisk nedbrytbar plast ved hjelp av abiotiske og biologiske midler ^15,16,17. Men disse metodene ikke ta nedbrytning av plast av private mikrobielle arter, eller gi metoder for isolering deres. Metoden heri mer ligner standard metoder utviklet for å evaluere plast for motstand mot mikrobiologisk nedbrytning etter inokulering av prøvene med soppsporer18,19.

Når preparater av plast er kjent og en kilde for råmaterialet er tilgjengelig, kan pulverisert plast bli suspendert i agar-baserte media og nedbrytning bestemt ved visualisering av clearing soner ^13. Denne metoden har vært brukt tidligere for å identifisere mikroorganismer som nedbrytes polymerer slik som polyuretan ^{20, 21,} poly-(butylen succinat-co–adipat) og poly (melkesyre) ^22. En lignende metode involverer suspendering ren pulverisert plast i flytende medium hvor plasten er den eneste karbonkilde ^20,23. Selv om disse metodene har fordelen av et definert system, de dårlig etterligne in situ nedbrytning av bdms. Først blir overflatearealet fordeles annerledes fordi bdms ikke er dispergert i små partikler i hele jord matrise, men snarere, solgt og brukt som filmer. Sekund, er den kjemiske sammensetningen av bdms forskjellig fra rene polymerer. Bdms generelt inneholder tilsetningsstoffer somfyllstoffer, myknere og fargestoffer, og disse tilsetningsstoffer kan påvirke mikrobiell vekst og dermed frekvensen av mineralisering. Av denne grunn, og fordi sammensetningen av visse kommersielle filmer i denne studien var proprietære, plastfilmen i sin felt-klar form ble benyttet til å isolere sopp og bakterier. For enkelhets skyld er de metoder som er beskrevet nedenfor bare for sopp, med modifikasjoner bemerket når det er hensiktsmessig for bakterielle isolasjoner.

I en fersk studie ²⁴ ble tre kommersielt tilgjengelige bdms og en eksperimentell film som brukes på landbruket i tre ulike regioner i USA for en vekstsesong, og deretter plassert i mesh (250 mikron) poser og begravet for en vinter i jord på de samme nettstedene. De 250 micron mesh åpninger tillate sopp hyfer å trenge mens unntatt røtter og de ​​fleste jord fauna, og minimere jord inngrep ^25,26. Nylon materialer forhindre pose nedbrytning i jord. Etter graving, fungal isolater ble gjenopprettet fra BDM stykker og vurderes for vekst på minimal medium uten en kilde til karbon med unntak av agar og en 5 cm x 5 cm overflate-disinfested kvadrat av ny, ubrukt BDM film som var pre-disinfested. De fleste plast som brukes som filmer kan ikke autoklaveres uten tap av integritet, ble så UV-lys brukes til å drepe eventuelle mikrobielle celler bosatt på plasten. ISO 846 ¹⁹ anbefales overflate-disinfesting i 70% etanol og påfølgende tørking, men ved bruk av denne metode, må man sørge for at ingen komponent eller tilsetning av filmen blir negativt påvirket av etanol. Siden bdms antagelig er produsert for å tåle sollys, ble UV valgt som en rensing metode.

Isolater som vokste på BDM biter bedre enn på minimal medium alene ble valgt ut for videre studier. Agar, et polysakkarid produsert av marine alger, blir brukt til å størkne mikrobielle mediet fordi det vanligvis ikke utnyttes metabolsk av agrikulturelt og ikke medisinskable mikroorganismer, men har agar-hydrolyzing enzymer blitt isolert fra marine bakterier ²⁷ og agar-hydrolyzing bakterier også er blitt isolert fra jord ^28.. BDM polymerer og agar forventes begge å være sjeldne substrater for enzymer utskilt av jord sopp, som ikke har utviklet seg i miljøer som inneholder disse polymerer som potensielle næringskilder, men begge substrater er til stede i platen bioassay beskrevet heri (trinn 7). Sopp som bruker bdms men ikke agar som karbonkilde kan skilles fra sopp som bruker agar bare ved å sammenligne vekst på agar-stivnet medium som inneholder i) uten tilsatt karbon kilde unntatt agar (negativ kontroll), ii) BDM filmer (eksperimentelt) og iii) glukose (positiv kontroll). Vekst av alle isolater er ventet på minimal medium + glukose, fungi som ikke kommer etter glukose-inneholdende plater kan ikke være i stand til vekst av den spesielle minimalt medium ble anvendt i forsøket. Potential BDM degraders bør vokse på agar-stivnet minimal medium + BDM film bedre enn de vokser på agar-stivnet minimal medium alene. Sopp vokser på minimal mellomstore platene er agar-degraders eller oligotrophs, og forventes også å vokse på agar forbundet med BDM filmer i bioassay plater, men ikke på selve filmene (med mindre de serendipitously også svekke BDM polymerer).

For å eliminere muligheten for å se mikrobiell vekst på grunn av utnyttelse av agar og ikke av bdms, etterfulgt vi vår innledende analysen for BDM kolonisering på agarplater med et bioassay med definert buljongmedium (trinn 9). BDM stykker representerte den eneste kjente karbonkilde i bioassay rør.

Etter den innledende screening, og ved å gjenopplive glyserol aksjer av isolatene, noen dannet snaut men synlig mycelia i flytende definert medium inneholder ingen kjent karbonkilde. Disse resultatene antydet at noen av de oppkjøpte isolatene var oligotrophs – organismer som vokser ved Scavenging svært små mengder av karbon, nitrogen og andre næringsstoffer oppløst enten i den vandige miljø eller eksisterende så flyktige i luften ^29,30,31. Artsbestemmelse via 18S ribosomal DNA-analyse støttet dette synet, så mange av isolatene matchet sopp slekter tidligere rapportert å stille oligotrophy ^32. Oligotrophs, som er vanlig saprophytes, krever et bredt spekter av metabolske funksjoner for substratutnyttelse i en rekke miljøer ^30. Således er det ikke overraskende at de samme sopp vi isolert fra bdms (formodentlig krever uvanlige enzymatiske evner) viste næringsfattige kapasiteter, og var i stand til å vokse på spor forurensninger slik som oljer fra fingeravtrykk, støv eller spor av flyktige bestanddeler i luften. På grunn av isolering av oligotrophs, konkluderte vi med at veksten på en BDM overflaten alene kan ikke brukes til å antyde BDM sammenbrudd. Metodene beskrevet her gjenspeiler vår innsats for å scReen innfødte BDM koloniherrer fra jordbruksjord for bona fide BDM sammenbrudd.

Protocol

Denne fremgangsmåte krever minst flere måneder for inkubering av BDM filmer i jord, og flere måneder for sekvensiell bioassays både på agarplater og i agar-fritt, kjemisk definert kjøttkraft for å vurdere kolonisering og degradering. Individuelle metoder er oppført i den rekkefølgen de vil bli utført. En. Inkubasjon av BDM Films i Soil Innlemme BDM filmer i jord under forhold som etterligner de under som de vil forventes å bli dårligere. Erverve 400 g (…

Representative Results

I en fersk undersøkelse 24, gjentak fire hver av tre kommersielt tilgjengelige bdms merket "nedbrytbart", pluss en eksperimentell film og en konvensjonell plast kontroll, ble plassert over jord som mulch for tomat produksjon i løpet av våren 2010 på Mount Vernon, WA, Knoxville, Tennessee, og Lubbock, TX. Høsten 2010 ble BDM film rutene kuttet fra hver forvitret mulch i fire replikere tomter, og stedlige masser ble fjernet fra rett under området der mulch prøven hadde blitt fjernet. Hver forvi…

Discussion

Prosedyren er beskrevet her representerer et første-pass teknikk for å isolere potensielle BDM degraders fra jord, og ble brukt til å isolere sopp fra bdms begravd i jord i sju måneder. Fungi vokste da reinoculated på fersk BDM materiale av samme type, noe som indikerer at de isolerte sopp var faktisk kolonisatorene, og at filmene var ikke hemmende overfor soppvekst. Isolering av plast-nedbrytende sopp og bakterier potensielt kan føre til deres bruk, enkeltvis eller i kombinasjoner, til endringer i jord eller komp…

Materials

Reagent Name	Company	Catalog Number	Comments
Potato Dextrose Agar	Becton Dickinson	8X05491
Agar	Fisher	BP 1423-2
Chloramphenicol	Acros Organics	200-287-4
Glutaraldehyde	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Toxic
Molecular sieve	Fisher	M-8892
Ethanol	Pharmco-Aaper	E200
Contrex	Decon Labs, Inc.	5204
Parafilm M	Pechiney Plastic Packaging	S37440
Mineral salts for buffers and media	Fisher	Various	Various vendors sell these reagents