Kwantitatieve Multispectral Analyse Na Fluorescent Tissue Transplantatie voor Visualisatie van de Cel Origins, types en interacties
Summary
Complex weefsel massa, van organen tumoren, zijn samengesteld uit verschillende cellulaire elementen. We opgehelderd de bijdrage van cellulaire fenotypes binnen een weefsel met behulp van multi-gelabelde fluorescerende transgene muizen in combinatie met multiparameter immunofluorescentiekleuring gevolgd door spectrale unmixing naar cel oorsprong evenals karakteristieken van de cel op basis van eiwit expressie ontcijferen.
Abstract
Met de wens om de bijdragen van verschillende cellulaire elementen voor de ontwikkeling van een complex weefsel begrijpen, zoals de vele celtypen die aan regenererend weefsel, tumorvorming of vasculogenese, ontwierpen we een veelkleurig cellulaire transplantatie model van tumorontwikkeling in die celpopulaties afkomstig uit verschillende fluorescentie gekleurde rapporteergen muizen worden getransplanteerd, geënt of geïnjecteerd in en rond een ontwikkelende tumor. De gekleurde cellen worden vervolgens gerekruteerd en opgenomen in de tumor stroma. Om beenmerg afgeleide tumor stromale cellen kwantitatief te beoordelen, we getransplanteerde GFP tot expressie transgene hele beenmerg in dodelijk bestraalde RFP uiten muizen zoals goedgekeurd door IACUC. 0ovarian tumoren die orthotopically werden geïnjecteerd in de getransplanteerde muizen uitgesneden 6-8 weken na implantatie en beenmerg marker vertrek (GFP) alsook antilichaam markers tumor geassocieerde detecteren geanalyseerdstroma behulp van multispectrale beeldvormende technieken. Vervolgens hebben we aangepast een methodiek we MIMicc-Multispectral Ondervraging van Multiplexed cellulaire composities noemen, met behulp van multispectrale unmixing van fluoroprobes kwantitatief beoordelen welke gelabelde cel kwam waaruit beginnen populaties (gebaseerd op originele reporter gen labels), en ons vermogen om te scheiden, 4, 5 , 6 of meer spectra per dia toeneemt, hebben we extra immunohistochemie verband met cellijnen of differentiatie om de precisie te verhogen toegevoegd. Gebruik te maken van software om co-gelokaliseerde multiplex-fluorescerende signalen, tumor stromale populaties kunnen worden getraceerd, geïnventariseerd en gekarakteriseerd op basis van marker vlekken op te sporen. 1
Introduction
Inzicht in de ontwikkeling en reparatie weefsel is belangrijk om het ophelderen van de deelnemende cellulaire componenten bij wondgenezing, 2,3 regeneratieve geneeskunde, ontwikkelingsbiologie en de tumor biologie. Onder omstandigheden van de reparatie, talrijke celtypen infiltreren de omringende micro-omgeving om te helpen bij vascularisatie, ECM afzetting, proliferatie en herstructurering weefsel. Cellulaire factoren en fenotypes worden geïdentificeerd op basis van multiparameter, multiplex markers die de lokalisatie kan identificeren, differentiatie status en interactie cellulaire componenten binnen de onderzochte micro. Hierin beschrijven we de ontwikkeling van tumoren als een prototypisch voorbeeld van deze multicolor-meercellige transplantatie model gevolgd door multispectrale beeldvorming en spectrale ontmenging methodologie.
Tumorprogressie is een proces van meerdere stappen dat wordt gekenmerkt door een aantal verworven mogelijkheden die verbeterde proliferatie, een onderntiapoptotic, invasieve en angiogene eigenschappen. 4 Tumor ontwikkeling wordt vergemakkelijkt door niet-neoplastische cellen die worden gerekruteerd in de omgeving groeifactoren, structurele matrices, vasculaire netwerken en immuunmodulatie bieden. 1,5,6 Dit microhabitat bestaat uit cellen afkomstig van lokaal, naburige weefsels zoals vet en bloedvaten en verre bronnen zoals beenmerg afgeleide cellen 1. De mate van niet-neoplastische cel opname hangt af van de vraag van de tumor, die vaak overeenkomt met de fase / graad van de tumor. De rol van het tumor ondersteunende micro begrijpen, moet men de oorsprong en de differentiatie potentieel van de niet-neoplastische cel populaties begrijpen.
Dit protocol is ontworpen om te helpen bij de interpretatie van tumorprogressie door visualisatie van zowel het beenmerg afgeleide cellulaire componenten en de lokale weefsel derived cellen. Gebruik te maken van fluorescerende reporter-gen uitdrukken transgene muizen, we getransplanteerd GFP (groen-fluorescerend eiwit) beenmerg in een dodelijk bestraald RFP (rood-fluorescerend eiwit) muis. Na succesvolle beenmerg aanslaan, is een syngene tumorcellijn orthotopically geïnjecteerd en mogen inenten voor 4-8 weken. De resulterende tumor wordt uitgesneden uit de muis en verwerkt voor immunofluorescentie (IF) kleuring om de stromale componenten te visualiseren. Multiplexing IF markers is een veelgebruikte techniek die aanzienlijke optimalisatie 7-9 omvat, maar met een multispectrale / unmixing platform verbetert de mogelijkheid van fluorescente merker combinaties die spectrale overlap hebben. Hierin presenteren we een techniek die we noemen MIMicc-multispectrale ondervraging gemultiplexte cellulaire samenstellingen om vlekken en analyseren maximaal acht merkers binnen een tumor gedeelte op een dia om de cellulaire oorsprong, celdifferentiatie st analyserenAtus en cel-cel interacties van onderdelen binnen de tumor micro-omgeving. Deze vereenvoudigde voorbeeld heeft het potentieel worden opgevoerd om vijf, zes of meer markeringen behulp antilichamen of intracellulair-promoter gedreven fluorescerende expressie. Tabel 1 geeft potentiële fluorescent antilichaam kleuring combinatie met geschikte soorten in aanmerking genomen te analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin beschrijven we de toepassing van multispectrale we beschrijven als MIMicc-multispectrale ondervraging gemultiplexte cellulaire samenstellingen, het beenmerg afgeleide stromale bestanddelen van de tumor micro-analyse, maar deze methode en concept kan worden toegepast op het ontcijferen andere cellulaire elementen die een complexe samenstellen weefsels zoals waargenomen tijdens wondgenezing reacties of tijdens een regeneratief weefsel. In deze experimenten gebruiken we transgene muizen fluorescent onderscheiden bee…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de discussies, begeleiding en steun van Drs. Michael Andreeff MD, PhD., En Jared Burks PhD. van het MD Anderson flowcytometrie en Cellular Imaging Core Facility. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van het National Cancer Institute (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 en CA109451 voor FCM. ELS wordt ook ondersteund door het Ministerie van Defensie Leger (BC083397).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||||||||||||||||
| .2 μm filter | Fisher | 09-740-35A | |||||||||||||||||||||||||||||
| 10 ml lure lock | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 25 G needle | Cardinal | BF305122 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 40nm filter | BD | 352340 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 50 ml conical tube | Fisher | 1495949A | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 488-ms1 | invitrogen | A21121 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 594-Rb | invitrogen | A21207 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 647-ch | Invitrogen | A21449 | |||||||||||||||||||||||||||||
| BSA | Sigma | A7906-500G | |||||||||||||||||||||||||||||
| Cover slips | Corning | 2940-243 | |||||||||||||||||||||||||||||
| CRI-Nuance | Caliper Life Sciences | ||||||||||||||||||||||||||||||
| Dapi | Invitrogen | D1306 | |||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | CellGro | 10-017-CV | |||||||||||||||||||||||||||||
| Ethanol | Dharmacon | 4004-DV | |||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | invitrogen | 16000-044 | |||||||||||||||||||||||||||||
| GFP-ms1 | Abcam | ab38689 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin needle | BD | 329424 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Maleic acid | Acros | 100-16-7 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Moisture chamber box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Mounting media | dako | S3023 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Nail hardener | Sally Hansen | 2103 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pap pen | Abcam | Ab2601 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pen/Strep L Glut | invitrogen | 10378016 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Steril PBS | invitrogen | 14040-182 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | invitrogen | 252000-56 | |||||||||||||||||||||||||||||
Blocking Buffer
Antigen retrieval buffers:
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
Riferimenti
- Kidd, S., et al. Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma. PLoS ONE. 7, e30563 (2012).
- Quintavalla, J., et al. Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects. Biomaterials. 23, 109-119 (2002).
- Sasaki, M. Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type. Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).
- Spaeth, E. L. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS ONE. 4, e4992 (2009).
- Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells. Genes and Development. 22, 559-574 (2008).
- Weis, S. M., Cheresh, D. A. Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets. Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).
- Bataille, F. Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).
- van Vlierberghe, R. L., et al. Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections. Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC cell biology. 9, 13 (2008).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
- Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. New routes for transgenesis of the mouse. Journal of applied. 53, 295-315 (2012).
