Analyse quantitative multispectrale Après transplantation de tissu fluorescent pour la visualisation des origines cellulaires, types et Interactions

Summary

Masses tissulaires complexes, à partir d'organes à des tumeurs, sont composées de différents éléments cellulaires. Nous avons élucidé la contribution des phénotypes cellulaires dans un tissu en utilisant des souris transgéniques fluorescentes marquées multi-paramètres multiples en combinaison avec la coloration par immunofluorescence suivie par déconvolution spectrale de déchiffrer l'origine de la cellule ainsi que les caractéristiques des cellules sur la base de l'expression de protéine.

Abstract

Avec la volonté de comprendre les contributions des éléments cellulaires multiples à l'élaboration d'un tissu complexe, tels que les nombreux types cellulaires qui participent à la régénération du tissu, formation d'une tumeur, ou la vasculogenèse, nous avons conçu un modèle de transplantation cellulaire multicolore de développement de tumeurs chez populations de cellules qui proviennent de différentes souris à gène rapporteur colorées par fluorescence et sont transplantés, greffés ou injectés dans et autour d'une tumeur en développement. Ces cellules colorées sont ensuite recrutés et incorporés dans le stroma tumoral. Afin d'évaluer quantitativement les cellules stromales de tumeurs dérivées de la moelle osseuse, nous avons transplanté exprimant la GFP ensemble transgénique moelle osseuse en DP mortellement irradié exprimer souris approuvé par IACUC. 0ovarian tumeurs qui ont été injectés de manière orthotopique dans les souris greffées ont été excisés 6-8 semaines après la prise de greffe et analysés pour le marqueur de la moelle osseuse d'origine (GFP) ainsi que des marqueurs d'anticorps pour détecter associé à une tumeurstroma en utilisant des techniques d'imagerie multispectrale. Nous avons ensuite adapté une méthode que nous appelons MIMicc-multispectrale Interrogation de compositions cellulaires multiplexés, en utilisant unmixing multispectrale de fluoroprobes d'évaluer quantitativement qui marqué cellule est venu à partir de laquelle les populations de départ (basé sur les étiquettes d'origine de gènes rapporteurs), et que notre capacité à unmix 4, 5 , 6 ou plusieurs spectres par glissement augmente, nous avons ajouté immunohistochimie supplémentaire associée à des lignées cellulaires ou la différenciation pour augmenter la précision. Utilisant le logiciel pour détecter les signaux multiplexés fluorescent co-localisées, les populations du stroma de la tumeur peuvent être tracées, énumérés et caractérisés en fonction de marqueur coloration. ¹

Introduction

Comprendre le développement et la réparation tissulaire est important d'élucider les composants cellulaires qui participent à la cicatrisation des plaies, ^2,3 médecine régénérative, la biologie du développement et de la biologie de la tumeur. Dans des circonstances de la réparation, de nombreux types de cellules infiltrent le microenvironnement entourant à l'aide de la vascularisation, le dépôt de l'ECM, la prolifération et la restructuration des tissus. Facteurs cellulaires et les phénotypes peuvent être identifiés sur la base de plusieurs paramètres, marqueurs multiplexés qui peuvent identifier la localisation, l'état de la différenciation et de l'interaction entre les composants cellulaires dans le microenvironnement enquête. Ici, nous décrivons le développement de la tumeur comme un exemple typique de ce modèle de greffe multicolore-multicellulaire suivi par imagerie multispectrale et la méthodologie de déconvolution spectrale.

La progression tumorale est un processus en plusieurs étapes qui est marquée par plusieurs capacités acquises qui incluent augmentation de la prolifération, unpropriétés ntiapoptotic, invasives et angiogéniques. ⁴ développement de la tumeur est facilitée par des cellules non néoplasiques qui sont recrutés dans l'environnement à fournir des facteurs de croissance, des matrices structurelles, les réseaux vasculaires et la modulation immunitaire. ^1,5,6 Ce micro-habitat est constitué de cellules dérivées de , les tissus locaux voisins tels que le tissu adipeux, et les vaisseaux sanguins et les sources lointaines comme la moelle osseuse des cellules dérivées ^1. L'étendue de l'incorporation des cellules non-néoplasiques dépend de la demande à partir de la tumeur, ce qui correspond souvent à l'étape / grade de la tumeur. Pour comprendre le rôle du micro-environnement de la tumeur de support, il faut comprendre l'origine et le potentiel de différenciation des populations de cellules non néoplasiques.

Ce protocole a été conçu pour aider à l'interprétation de la progression de la tumeur par le biais de la visualisation à la fois des composants cellulaires dérivées de la moelle osseuse, et la deriv tissulaire localecellules ed. Utilisant des souris fluorescentes de gènes exprimant journaliste transgéniques, nous avons transplanté GFP (protéine fluorescente verte) de la moelle osseuse dans un DP mortellement irradié (protéine rouge fluorescente) de la souris. Suite au succès la prise de greffe de moelle osseuse, une lignée cellulaire de tumeur syngénique est injecté orthotopique et on le laisse se greffer à 4-8 semaines. La tumeur résultant est excisé de la souris et traitées pour immunofluorescence (IF) pour visualiser la coloration des composants du stroma. Multiplexage SI marqueurs est une technique couramment utilisée qui implique une optimisation considérable ^9.7, mais en utilisant une plate-forme d'imagerie / de démixage multispectral améliore le potentiel de combinaisons de marqueurs fluorescents qui possèdent un recouvrement spectral. Nous présentons ici une technique que nous appelons interrogation MIMicc-multispectrale de compositions cellulaires multiplexés pour colorer et analyser jusqu'à huit marqueurs d'une section de la tumeur sur une seule lame afin d'analyser les origines cellulaires, la différenciation cellulaire stATU et les interactions cellule-cellule des composants dans le microenvironnement tumoral. Cet exemple simplifié a le potentiel d'être développée afin d'analyser cinq, six, ou plusieurs marqueurs utilisant des anticorps ou intracellulaire expression fluorescent promoteur-entraînée. Tableau 1 énumère potentiels fluorescentes combinaisons anticorps de coloration avec des espèces appropriées prises en compte.

Protocol

Syngénique murin de moelle osseuse (GMO), tel qu'approuvé par les protocoles institutionnels IACUC (Note: Le succès de ce protocole nécessite l'utilisation de n'importe quel type de cellule marquée (s) comme cible pour l'analyse multispectrale, et de faciliter l'analyse en aval, on peut exploiter tout génétique ou l'étiquetage cellulaire stable. Nous suggérons que n'importe quelle cellule, tissu ou organe à-être-peut être appliquée à un modèle de transplantatio…

Representative Results

En utilisant une technique d'imagerie multispectrale pour analyser les tumeurs greffées dans notre modèle de souris transgénique BMT, nous sommes en mesure de discerner les composants de tumeurs stromales qui sont d'origine de la moelle osseuse. La première greffe de moelle osseuse a été confirmé trois semaines après la transplantation par cytométrie de flux (Figure 1). Orthotopiquement injecté tumeurs ovariennes non étiquetés suivant BMT confirmations de prise de greffe ont été ex…

Discussion

Nous décrivons ici l'application de l'imagerie multispectrale, nous décrivons comme interrogation MIMicc-multispectrale de compositions cellulaires multiplexés, pour analyser la moelle osseuse provenant composantes stromales du microenvironnement de la tumeur, mais cette méthodologie et le concept peut être appliqué à déchiffrer d'autres éléments cellulaires qui composent un complexe tissus tels que ceux observés lors des réactions de cicatrisation des plaies ou lors d'un tissu régénératri…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
			Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml