Kvantitativ Multispectral Analyse Etter Fluorescent Tissue Transplant for visualisering av Cell Origins, Typer, og interaksjoner

Summary

Komplekse vev massene, av organer til tumorer, er sammensatt av forskjellige cellulære elementer. Vi belyst bidrag av cellulære fenotyper i en vev utnytte multi-merket fluorescerende transgene mus i kombinasjon med multiparameter immunofluorescent flekker etterfulgt av spektral unmixing å dechiffrere celle opprinnelse samt celleegenskaper basert på protein uttrykk.

Abstract

Med ønske om å forstå bidragene fra flere cellulære elementer til å utvikle et sammensatt vev, slik som de tallrike celletyper som deltar i regenererende vev, tumordannelse, eller vaskulogenese, har vi utviklet en flerfarget celletransplantasjonsmodell for tumorutvikling som cellepopulasjoner stammer fra forskjellige fluorescently fargede reporter gen mus og er transplantert, innpodet eller injiseres i og rundt et utviklings svulst. Disse fargede cellene blir deretter rekruttert og inkorporert inn i svulsten stroma. For å kvantitativt vurdere benmarg avledet stromale tumorceller, transplantert vi GFP uttrykker transgene hele benmarg inn lethally bestrålt RFP uttrykke mus som er godkjent av IACUC. 0ovarian svulster som ble orthotopically injisert i de transplanterte musene ble skåret i 6-8 uker etter engraftment og analysert for benmargs markør utstedt (GFP), så vel som antistoff-markører for å påvise tumor assosiertstroma bruker multispektrale bildeteknikker. Vi deretter tilpasset en metode vi kaller MIMicc-Multispectral Avhør av multiplekskanaler cellulære komposisjoner, ved hjelp av multispektrale unmixing av fluoroprobes til kvantitativt vurdere hvilke merket celle kom fra hvilke start populasjoner (basert på originale reporter gen etiketter), og som vår evne til å unmix 4, 5 , 6 eller flere spektra per lysbilde øker, har vi lagt ekstra immunhistokjemi forbundet med celle linjene eller differensiering for å øke presisjonen. Utnytte programvare for å oppdage samlokalisert multipleksede-fluorescerende signaler, svulst stromal populasjoner kan spores, oppregnet og preget basert på markør farging. ¹

Introduction

Forstå vev utvikling og reparasjon er viktig å belyse deltar cellulære komponenter i sårheling, ^2,3 regenerativ medisin, utviklingsbiologi og tumorbiologi. Under omstendighetene reparasjon, mange celletyper infiltrere omkringliggende mikromiljøet til hjelp i vascularization, ECM deponering, spredning og vev restrukturering. Cellulære faktorer og fenotyper kan identifiseres basert på multiparameter, multipleksede markører som kan identifisere lokalisering, differensiering status og samhandling mellom cellulære komponenter innenfor undersøkt mikromiljøet. Heri beskriver vi tumor utvikling som en prototypisk eksempel på dette flerfarget-flercellet transplantasjon modellen etterfulgt av multispektrale bildebehandling og spektral unmixing metodikk.

Tumorprogresjon er en flertrinns prosess som er preget av flere oppkjøpte funksjoner som omfatter økt spredning, enntiapoptotic, invasive og angiogenetiske egenskaper. ⁴ Tumor utvikling er tilrettelagt av ikke-neoplastiske celler som er rekruttert inn i det omkringliggende miljø for å gi vekstfaktorer, strukturelle matriser, vaskulære nettverk og immunmodulering. ^1,5,6 Denne mikrohabitat består av celler som stammer fra lokale, nabo vev som adipose, og blodårer og fjerne kilder som for eksempel benmarg avledet celler ^en. Graden av ikke-neoplastisk celle inkorporering avhenger av etterspørselen fra tumoren, noe som ofte er den samme som fasen / karakteren av svulsten. For å forstå rollen av svulsten støttende mikromiljøet, må man forstå opprinnelsen og differensiering potensial av de ikke-neoplastiske cellepopulasjoner.

Denne protokoll er blitt utviklet for å hjelpe til med forståelsen av tumor progresjon gjennom visualisering av både benmarg avledet cellulære komponenter, og det lokale vevet derived celler. Utnytte fluorescerende reporter gen-uttrykke transgene mus, transplantert vi GFP (green-fluorescerende protein) benmarg til en lethally bestrålt RFP (red-fluorescerende protein) mus. Etter vellykket benmarg engraftment, er en syngene tumor cellelinje injisert orthotopically og lov til å innpode i 4-8 uker. Den resulterende tumor er fjernet fra musen og behandlet for immunofluorescent (IF) farging for å visualisere de stromale komponenter. Multipleksing IF markører er en vanlig brukt teknikk som innebærer betydelig optimalisering ^7-9, men ved hjelp av en multispektrale avbildning / unmixing plattformen øker potensialet for fluoriserende fargestoff kombinasjoner som besitter spektral overlapping. Heri vi presentere en teknikk vi kaller MIMicc-multispektrale avhør av multiplekskanaler cellulære komposisjoner å farge og analysere opptil åtte markører innenfor en svulst seksjon på et enkelt lysbilde for å analysere de cellulære opprinnelse, cellulær differensiering stAtus og celle-celle interaksjoner av komponenter innenfor tumormikromiljøet. Dette forenklet eksempel har potensial til å bli utvidet på for å analysere fem, seks eller flere markører utnytte antistoffer eller intracellulær promoter-drevet fluorescerende uttrykk. Tabell 1 lister potensielle fluorescerende antistoffarging kombinert med egnede arter tatt i betraktning.

Protocol

Syngene Murine benmargstransplantasjon (BMT) som er godkjent av institusjonelle IACUC protokoller (Merk: Suksess for denne protokollen krever utnyttelse av eventuelle merket celletype (r) som mål for multispektrale analyse, og å legge til rette for nedstrøms analyse, kan man utnytte noen genetiske eller stabil cellemerking. Vi foreslår at en hvilken som helst celle, vev eller organ-å-være kan påføres på et transplantat modell og at transplantatet kan inneholde så mange unike merkede populasjon…

Representative Results

Ved hjelp av en multispektrale avbildningsteknikk å analysere svulster innpodet i vår transgen BMT mus modell, er vi i stand til å skjelne stromal tumor komponenter som er av benmargen opprinnelse. Den innledende BMT ble bekreftet tre uker etter transplantasjonen ved strømningscytometri (figur 1). Orthotopically injisert umerkede ovarietumorer følgende BMT engraftment bekreftelser ble skåret ut og formalinfiksert seks uker etter innledende svulst injeksjon. Parafin innebygd tumor delene ble seksjo…

Discussion

Heri beskriver vi anvendelse av multispektrale avbildning vi beskrive som MIMicc-multispektrale utspørring av Multiplexed cellulære sammensetninger, for å analysere de benmarg avledet stromale komponenter i tumor mikromiljøet, men denne metodikk og konsept kan benyttes til å tolke andre cellulære elementer som utgjør et komplekst vev som de sett under sårtilheling reaksjoner eller under en regenerativ vev. I disse forsøk benytter vi transgene mus for å fluorescensmerket skille de benmargceller avledet fra vert…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
			Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml