Massas de tecido complexos, a partir de órgãos de tumores, são compostas de vários elementos celulares. Nós elucidada a contribuição de fenótipos celulares dentro de um tecido utilizando ratinhos transgénicos fluorescentes multi-marcados em combinação com coloração de imunofluorescência multiparamï seguido de separação espectral para decifrar origem celular, bem como características de células com base na expressão da proteína.
Com o desejo de compreender as contribuições de múltiplos elementos celulares para o desenvolvimento de um tecido complexo, tais como os numerosos tipos de células que participam na regeneração do tecido, a formação do tumor, ou vasculogénese, concebemos um modelo de multi-colorida de transplante celular de desenvolvimento de tumores em que populações de células provenientes de diferentes camundongos gene repórter coloridas e fluorescentes são transplantadas, enxertados ou injetado e em torno de um tumor em desenvolvimento. Estas células são, então, recrutados coloridas e incorporada no estroma do tumor. Para avaliar quantitativamente derivadas da medula óssea células do estroma tumorais, nós transplantado GFP expressando transgênico medula óssea em todo RFP letalmente irradiados expressando camundongos aprovado pelo IACUC. 0ovarian tumores que foram ortotopicamente injetadas nos ratos transplantados foram excisadas 6-8 semanas pós enxerto e analisadas para o marcador de medula óssea de origem (GFP), bem como marcadores de anticorpos para detectar tumor associadoestroma usando técnicas de imagem multiespectrais. Em seguida, adaptado de uma metodologia que chamamos MIMicc-Multispectral Interrogatório de composições diversificadas celulares, usando desmistura multiespectral de fluoroprobes avaliar quantitativamente qual rotulado célula veio a partir do qual as populações iniciais (com base em rótulos originais de gene repórter), e como a nossa capacidade de unmix 4, 5 , 6 ou mais espectros por slide aumenta, nós adicionamos imunohistoquímica adicional associado com linhagens de células ou de diferenciação para aumentar a precisão. Utilizando o software para detectar sinais multiplexados fluorescente co-localizadas, as populações do estroma tumorais podem ser rastreados, enumeradas e caracterizadas com base na coloração do marcador. 1
Compreender o desenvolvimento e reparação dos tecidos é importante para elucidar participantes componentes celulares na cicatrização de feridas, 2,3 medicina regenerativa, biologia do desenvolvimento e biologia do tumor. Em circunstâncias de reparação, numerosos tipos de células infiltrar o microambiente circundante para ajudar na vascularização, a deposição de ECM, a proliferação e reestruturação de tecidos. Factores celulares e fenótipos podem ser identificados com base em multiparamétrica, marcadores multiplexados que podem identificar a localização, o estado de diferenciação e a interacção entre os componentes celulares dentro do microambiente investigada. Relata-se o desenvolvimento do tumor como um exemplo prototípico para este modelo de transplante multicolor-multicelular seguido de imagens multiespectrais e metodologia desmistura espectral.
A progressão tumoral é um processo em várias etapas, que é marcada por várias capacidades adquiridas, que incluem a proliferação aumentada, umaPropriedades ntiapoptotic, invasivos e angiogénicos. 4 O desenvolvimento do tumor é facilitada por células não neoplásicas que são recrutadas para o ambiente circundante para fornecer factores de crescimento, as matrizes estruturais, redes vasculares e de modulação imunitária. 1,5,6 Este microhábitat consiste de células derivadas a partir de tecidos locais, vizinhos, como adiposo e vasos sanguíneos e de fontes distantes, como medula óssea, células derivadas 1. A extensão da incorporação de células não neoplásicas depende da demanda do tumor, o que corresponde geralmente à fase / grau do tumor. Para compreender o papel do microambiente favorável tumor, é preciso entender a origem eo potencial de diferenciação das populações de células não neoplásicas.
Este protocolo foi concebido para auxiliar a interpretação da progressão do tumor por meio da visualização de ambas as da medula óssea derivadas de componentes celulares, e o local do tecido derivcélulas ed. Utilizando camundongos fluorescentes expressando gene repórter transgênicos, nós transplantados de medula GFP (proteína verde fluorescente) osso em uma RFP letalmente irradiados (proteína vermelha fluorescente) do mouse. Seguindo o enxerto de medula óssea com êxito, uma linha de células de tumor singeneico é injectado ortotopicamente e deixou-se enxertar por 4-8 semanas. O tumor resultante é excisado do rato e processada para imunofluorescência (IF) de coloração para visualizar os componentes do estroma. Multiplexing IF marcadores é uma técnica comumente usada que envolve otimização significativa 7-9, porém utilizando uma plataforma de imagem / desmistura multiespectral melhora o potencial de combinações de marcadores fluorescentes que possuem sobreposição espectral. Apresentamos aqui uma técnica que chamamos de interrogatório MIMicc-multiespectral de composições celulares multiplexados para manchar e analisar até oito marcadores dentro de uma seção de tumor em um único slide, a fim de analisar as origens celulares, diferenciação celular rualhos e as interações célula-célula de componentes dentro do microambiente do tumor. Este exemplo simplificado tem o potencial para ser expandida a fim de analisar cinco, seis ou mais marcadores, utilizando anticorpos ou expressão fluorescente-driven promotor intracelular. Tabela 1 apresenta potenciais combinações de coloração de anticorpos fluorescentes com espécies adequadas, tomadas em conta.
Aqui nós descrevemos a aplicação de imagens multiespectrais que descrevemos como interrogatório MIMicc-multiespectral de composições celulares diversificadas, para analisar as da medula óssea componentes estromais derivadas do microambiente do tumor, porém essa metodologia e conceito pode ser aplicado a decifrar outros elementos celulares que compõem um complexo tecidos, tais como os observados durante a cicatrização de feridas ou reacções durante um tecido regenerativo. Nestas experiências que utilizam ra…
The authors have nothing to disclose.
Somos gratos ao discussões, orientação e apoio dos drs. Michael Andreeff MD, PhD., E Jared Burks doutorado. do MD Anderson Citometria de Fluxo e Celular Imagem Núcleo Facility. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Instituto Nacional do Câncer (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 e CA109451 para a FCM. ELS também é apoiado pelo Departamento do Exército de Defesa (BC083397).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||||||||||||||||
.2 μm filter | Fisher | 09-740-35A | |||||||||||||||||||||||||||||
10 ml lure lock | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||
25 G needle | Cardinal | BF305122 | |||||||||||||||||||||||||||||
40nm filter | BD | 352340 | |||||||||||||||||||||||||||||
50 ml conical tube | Fisher | 1495949A | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 488-ms1 | invitrogen | A21121 | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 594-Rb | invitrogen | A21207 | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 647-ch | Invitrogen | A21449 | |||||||||||||||||||||||||||||
BSA | Sigma | A7906-500G | |||||||||||||||||||||||||||||
Cover slips | Corning | 2940-243 | |||||||||||||||||||||||||||||
CRI-Nuance | Caliper Life Sciences | ||||||||||||||||||||||||||||||
Dapi | Invitrogen | D1306 | |||||||||||||||||||||||||||||
DMEM | CellGro | 10-017-CV | |||||||||||||||||||||||||||||
Ethanol | Dharmacon | 4004-DV | |||||||||||||||||||||||||||||
FBS | invitrogen | 16000-044 | |||||||||||||||||||||||||||||
GFP-ms1 | Abcam | ab38689 | |||||||||||||||||||||||||||||
Insulin needle | BD | 329424 | |||||||||||||||||||||||||||||
Maleic acid | Acros | 100-16-7 | |||||||||||||||||||||||||||||
Moisture chamber box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |||||||||||||||||||||||||||||
Mounting media | dako | S3023 | |||||||||||||||||||||||||||||
Nail hardener | Sally Hansen | 2103 | |||||||||||||||||||||||||||||
Pap pen | Abcam | Ab2601 | |||||||||||||||||||||||||||||
Pen/Strep L Glut | invitrogen | 10378016 | |||||||||||||||||||||||||||||
Steril PBS | invitrogen | 14040-182 | |||||||||||||||||||||||||||||
Trypsin | invitrogen | 252000-56 | |||||||||||||||||||||||||||||
Blocking Buffer
Antigen retrieval buffers:
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