Análisis Cuantitativo multiespectrales después de un trasplante de tejido fluorescente para la visualización de los Orígenes celulares, tipos y Interacciones

Summary

Masas de tejido complejo, de órganos a los tumores, se componen de diversos elementos celulares. Hemos dilucidado la contribución de los fenotipos celulares dentro de un tejido utilizando ratones transgénicos fluorescentes de múltiples etiquetados en combinación con la tinción de inmunofluorescencia seguido de multiparamétrico desmezcla espectrales de descifrar origen celular, así como características de células basado en la expresión de proteínas.

Abstract

Con el deseo de entender las contribuciones de múltiples elementos celulares para el desarrollo de un tejido complejo; tales como los numerosos tipos de células que participan en la regeneración de tejido, la formación del tumor, o la vasculogénesis, ideamos un modelo de trasplante celular multi-color de desarrollo de tumores en que las poblaciones de células se originan de diferentes colores reportero ratones de genes con fluorescencia y se trasplantan, injertados o se inyectan en y alrededor de un tumor en desarrollo. Estas células coloreadas se reclutaron y se incorporan en el estroma tumoral. Con el fin de evaluar cuantitativamente la médula ósea células del estroma derivadas de tumores, transplantamos que expresan GFP transgénica médula ósea entera en RFP letalmente irradiados expresando ratones aprobado por el IACUC. Tumores 0ovarian que fueron inyectados ortotópicamente en los ratones transplantados fueron extirpados 6-8 semanas después del injerto y se analizaron para marcador de médula ósea de origen (GFP), así como marcadores de anticuerpos para detectar tumor asociadoestroma utilizando técnicas de imagen multiespectral. A continuación, se adaptó una metodología que llamamos MIMicc-multiespectral Interrogación de composiciones celulares multiplexados, usando desmezcla multiespectral de fluoroprobes para evaluar cuantitativamente que la etiqueta de células vino de que poblaciones de partida (basados ​​en las etiquetas originales de gen reportero), y como nuestra capacidad para unmix 4, 5 , 6 o más espectros por aumentos de diapositivas, hemos añadido inmunohistoquímica adicional asociada con linajes celulares o diferenciación para aumentar la precisión. La utilización de software para detectar señales multiplexadas fluorescente co-localizados, las poblaciones del estroma tumoral pueden ser rastreados, enumerados y caracterizaron basándose en la tinción marcador. ¹

Introduction

Comprender el desarrollo de tejidos y la reparación es importante para dilucidar los componentes celulares que participan en la cicatrización de heridas, ^2,3 medicina regenerativa, la biología del desarrollo y la biología del tumor. En circunstancias de reparación, numerosos tipos de células se infiltran en el microambiente que rodea a la ayuda en la vascularización, la deposición de ECM, la proliferación y la reestructuración del tejido. Factores celulares y fenotipos se pueden identificar sobre la base de multiparamétrico, marcadores multiplexados que pueden identificar la localización, estado de diferenciación y la interacción entre los componentes celulares dentro de la microambiente investigado. Aquí se describe el desarrollo del tumor como un ejemplo prototípico de este modelo de trasplante multicolor multicelular seguido de imágenes multiespectrales y la metodología desmezcla espectral.

La progresión tumoral es un proceso de varios pasos que se caracteriza por varias capacidades adquiridas que incluyen una mayor proliferación, unpropiedades ntiapoptotic, invasivos y angiogénicos. ⁴ Desarrollo de tumores se ve facilitada por las células no neoplásicas que son reclutados en el ambiente circundante para proporcionar factores de crecimiento, matrices estructurales, redes vasculares y la modulación inmune. ^1,5,6 Este microhábitat consiste en células derivadas de tejidos locales, vecinos como adiposo y vasos sanguíneos y fuentes distantes, como la médula ósea células derivadas ^1. El grado de incorporación de células no-neoplásica depende de la demanda del tumor, que a menudo corresponde con la etapa / grado del tumor. Para comprender el papel del microambiente del tumor de apoyo, hay que entender el origen y el potencial de diferenciación de las poblaciones de células no neoplásicas.

Este protocolo ha sido diseñado para ayudar en la interpretación de la progresión del tumor a través de la visualización tanto de los componentes celulares derivadas de médula ósea, y el tejido local Derivcélulas ed. Utilizando ratones transgénicos fluorescentes reportero de genes que expresan, transplantamos GFP (proteína verde fluorescente) de la médula ósea en un RFP irradiados letalmente (proteína roja fluorescente) del ratón. Después de éxito del injerto de médula ósea, una línea celular de tumor singénico se inyecta ortotópicamente y se dejó que se injertan durante 4-8 semanas. El tumor resultante se escindió del ratón y se procesaron para inmunofluorescencia (IF) y la tinción para visualizar los componentes del estroma. Multiplexación IF marcadores es una técnica de uso común que implica una optimización significativa ^{de 7-9,} sin embargo el uso de una plataforma de imágenes / desmezcla multiespectral mejora el potencial de combinaciones de marcadores fluorescentes que poseen solapamiento espectral. El presente artículo presenta una técnica que llamamos interrogatorio MIMicc-multiespectral de composiciones celulares multiplexados para teñir y analizar hasta ocho marcadores dentro de una sección del tumor en una sola diapositiva con el fin de analizar los orígenes celulares, diferenciación celular stratos y las interacciones célula-célula de componentes dentro del microambiente del tumor. Este ejemplo simplificado tiene el potencial de ser ampliado a fin de analizar cinco, seis, o más marcadores que utilizan anticuerpos o expresión fluorescente promotor impulsado intracelular. Tabla 1 se enumeran las posibles combinaciones de tinción de anticuerpos fluorescentes con especies apropiadas tomadas en cuenta.

Protocol

Singenéico murino Trasplante de médula ósea (BMT), aprobados por los protocolos del IACUC institucional (Nota: El éxito de este protocolo requiere la utilización de cualquier tipo de célula marcada (s) como objetivo para el análisis multiespectral, y para facilitar el análisis de aguas abajo, se puede explotar cualquier genética o etiquetado celular estable. Sugerimos que cualquier célula, tejido, u órgano-a-ser puede ser aplicada a un modelo de trasplante y de que el trasplante puede contene…

Representative Results

Usando una técnica de imagen multiespectral para analizar tumores injertados en nuestro modelo de ratón transgénico BMT, somos capaces de discernir los componentes de tumores del estroma que son de origen de la médula ósea. El primer trasplante de médula ósea fue, confirmado tres semanas después del trasplante mediante citometría de flujo (Figura 1). Ortotópicamente inyecta tumores ováricos no marcados siguiente confirmaciones injerto BMT fueron extirpados y fijadas en formol 6 semanas despu?…

Discussion

Aquí se describe la aplicación de imágenes multiespectrales que describimos como interrogación MIMicc-multiespectral de composiciones celulares multiplexados, para analizar los componentes derivados de la médula ósea del estroma de la microambiente del tumor, sin embargo esta metodología y el concepto se puede aplicar a descifrar otros elementos celulares que componen un complejo tejidos tales como los que se observan durante las reacciones de curación de heridas o durante un tejido regenerativo. En estos experi…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
			Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml