Kvantitativ Multispectral Analys Efter Lysrör Tissue Trans för visualisering av Cell Origins, typer, och interaktioner

Summary

Komplexa vävnadsmassor, från organ till tumörer, består av olika cellulära element. Vi klar bidrag cellulära fenotyper inom en vävnad som använder multi-märkta fluorescerande transgena möss i kombination med multi immunofluorescens färgning följt av spektral unmixing att dechiffrera cell ursprung samt cellernas egenskaper baserade på proteinuttryck.

Abstract

Med en önskan att förstå bidragen från flera cellulära element för utvecklingen av en komplex vävnad, till exempel de många celltyper som deltar i regenerera vävnad, tumörbildning, eller vaskulogenes, vi utarbetat en flerfärgad celltransplantationsmodell för tumörutveckling i vilken cellpopulationer kommer från olika fluorescerande färgade reporter gen möss och transplanteras, engrafted eller injiceras i och kring en utveckling av tumör. Dessa färgade celler sedan rekryteras och införlivas i tumören stroma. För att kvantitativt bedöma benmärg härledda tumör stromaceller, transplanterade vi GFP uttrycka transgena hel benmärg in i dödligt bestrålade RFP uttrycka möss som godkänts av IACUC. 0ovarian tumörer som ortotopiskt injiceras i de transplanterade mössen exciderades 6-8 veckor efter inympning och analyserades för benmärgs markör av ursprung (GFP) samt markörer antikropp för att detektera tumörassocieratstroma med hjälp av multispektrala avbildningstekniker. Vi anpassade då en metod som vi kallar MIMicc-Multispectral Förhör av Multiplexad cellulära kompositioner, med hjälp av multispektrala unmixing av fluoroprobes att kvantitativt bedöma vilka märkta cellen kom från vilken start populationer (baserat på ursprungliga reporter gen etiketter), och som vår förmåga att unmix 4, 5 , 6 eller fler spektra per slide ökar, har vi lagt till ytterligare immunhistokemi i samband med cellhärstamningar eller differentiering för att öka precisionen. Använda programvara för att upptäcka co-lokaliserade multiplexade-fluorescerande signaler, tumör stromal populationer kan spåras, räknas och karaktäriseras utifrån markör färgning. ¹

Introduction

Förstå vävnadsutveckling och reparation är viktigt att belysa deltar cellkomponenter i sårläkning, ^2,3 regenerativ medicin, utvecklingsbiologi och tumörbiologi. Under omständigheterna reparation, många celltyper infiltrera omgivande mikromiljö till stöd i vaskularisering, ECM nedfall, spridning och omstrukturering vävnad. Cellulära faktorer och fenotyper kan identifieras utifrån multi, multiplexade markörer som kan identifiera lokaliseringen, differentieringsstatus och interaktion mellan cellkomponenter inom det undersökta mikromiljö. Häri beskriver vi tumörutveckling som en prototypiska exempel för denna multicolor-flercellig transplantationsmodell följt av multispektrala avbildning och spektral unmixing metodik.

Tumörprogression är en flerstegsprocess som präglas av flera förvärvade förmågor som inkluderar förbättrad spridning, enntiapoptotic, invasiva och angiogena egenskaper. ^fyra Tumör utveckling främjas av icke-neoplastiska celler som rekryteras till den omgivande miljön för att ge tillväxtfaktorer, strukturella matriser, vaskulära nätverk och immunmodulering. ^1,5,6 Denna microhabitat består av celler som härrör från lokal, angränsande vävnader såsom fett, och blodkärl och avlägsna källor såsom benmärg härledda celler ^1. Omfattningen av icke-neoplastisk cell inkorporering beror på efterfrågan från tumören, vilket ofta motsvarar scenen / grad av tumören. För att förstå betydelsen av tumören stödjande mikromiljö, måste man förstå ursprunget och differentieringspotentialen av de icke-neoplastiska cellpopulationer.

Detta protokoll har utformats för att hjälpa till vid tolkning av tumörprogression genom visualisering av både benmärg härledda cellkomponenter, och den lokala vävnads derived celler. Med hjälp av fluorescerande reporter gen-uttryckande transgena möss, transplanterade vi GFP (grönt fluorescerande protein) benmärg i ett dödligt bestrålat RFP (röd-fluorescerande protein) mus. Efter lyckad benmärgs engraftment, är en syngent tumörcellinjen injiceras orthotopically och får ympas i 4-8 veckor. Den resulterande tumören skärs ut från musen och bearbetades för immunofluorescens (IF)-färgning för att visualisera de stromala komponenter. Multiplexing IF markörer är en vanligt förekommande teknik som innebär betydande optimering ^7-9, men med hjälp av en multispektrala avbildning / unmixing plattform förbättrar potentialen för fluorescerande markörkombinationer som besitter spektral överlappning. Häri presenterar vi en teknik som vi kallar MIMicc-multispektrala förhör av Multiplexade cellulära kompositioner för att färga och analysera upp till åtta markörer inom en tumör avsnitt om en enda bild för att analysera de cellulära ursprung, celldifferentiering stparater och cell-cell interaktioner av komponenter inom tumormicroenvironmenten. Denna förenklade exempel har potential att byggas ut på för att analysera fem, sex eller fler markörer som använder antikroppar eller intracellulär promotor-driven fluorescerande uttryck. Tabell 1 listar potentiella fluorescerande antikroppsfärgnings kombinationer med lämpliga arter beaktas.

Protocol

Syngent Murina benmärgstransplantation (BMT) som har godkänts av institutionella IACUC protokoll (Obs: Framgång för detta protokoll kräver användning av det märkta celltyp (ar) som mål för multispektrala analys, och för att underlätta den efterföljande analysen, man kan utnyttja någon genetisk eller stabil cellmärkning. Vi föreslår att alla celler, vävnader eller organ-till-vara kan tillämpas på ett transplantationsmodell och att transplantationen kan innehålla så många unika märk…

Representative Results

Med hjälp av en multispektrala bildteknik för att analysera tumörer engrafted i vår transgena BMT musmodell, kan vi urskilja stromal tumör komponenter som är av benmärgs ursprung. Den initiala BMT bekräftades tre veckor efter transplantation genom flödescytometri (figur 1). Orthotopically injicerade omärkta äggstockstumörer efter BMT transplantations bekräftelser skars ut och formalin fast 6 veckor efter initial tumörinjektion. Paraffin inbäddad tumörsektioner snittades i <8 ìm skivo…

Discussion

Häri beskriver vi tillämpningen av multispektrala avbildning vi beskriver som MIMicc-multispektral förhör av Multiplexad cellulära kompositioner, för att analysera de benmärg härledda stromaceller komponenterna tumormicroenvironmenten emellertid denna metod och koncept kan appliceras på dechiffrera andra cellulära element som utgör en komplex vävnader, såsom de som ses under sårläkning reaktioner eller under en regenerativ vävnad. I dessa experiment använder vi transgena möss för att fluorescens särs…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
			Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml