מיקרוסקופית גומלת לניתוח מבני 3D של אינטראקציות דינמיות
Summary
אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופית במהירות גבוהה 3D לחיות תאי ניאון אור וטומוגרפיה קריו אלקטרונים ברזולוציה גבוהה. אנחנו מדגימים את יכולתה של השיטה הגומלת על ידי הדמיה דינמית, חלקיקי אינטראקציה עם תאי הלה מארחות הקטנים HIV-1.
Abstract
Cryo-אלקטרון טומוגרפיה (cryoET) מאפשרת הדמיה 3D של מבנים הסלולר ברזולוציה מולקולרית במצב קרוב לפיסיולוגי 1. עם זאת, להדמיה ישירה של מתחמים נגיפיים בודדים בסביבה התאית שלהם עם מארח cryoET מאתגרת 2, בשל האופי נדיר ודינמי של כניסת ויראלי, במיוחד במקרה של HIV-1. בעוד לחיות תאי הדמיה זמן לשגות הניבה מידע רב על היבטים רבים של המחזור של 3-7 HIV-1 החיים, המוענקת על ידי מיקרוסקופיה ברזולוציה לחיות תאים הוא מוגבל (~ 200 ננומטר). העבודה שלנו הייתה במטרה לפתח שיטת מתאם המאפשרת הדמיה ישירה של אירועים המוקדמים של HIV-1 זיהום על ידי שילוב של מיקרוסקופ אור ניאון לחיות תאים, מיקרוסקופיה קריו פלורסנט, וcryoET. באופן זה, ניתן להשתמש באותות בתאים חיים וcryo-ניאון כדי להנחות את הדגימה בcryoET במדויק. יתר על כן, מידע מבני מתקבל מcryoET יכול בהדואר השלים עם הנתונים הפונקציונליים הדינמיים שנרכש דרך לחיות תאי הדמיה של היעד מסומן ניאון.
במאמר זה וידאו, אנו מספקים שיטות ופרוטוקולים מפורטות לחקירה מבנית של HIV-1 ואינטראקציות מארח תאים באמצעות הדמיה 3D גומלת במהירות גבוהה תאי חיים וניתוח מבני ברזולוציה גבוהה cryoET. תאים הלה נגועים בחלקיקי HIV-1 אופיינו לראשונה על ידי מיקרוסקופיה confocal לחיות תאים, ובאזור המכיל אותו החלקיק הנגיפי נותח ולאחר מכן על ידי טומוגרפיה קריו אלקטרון לפרטים מבניים 3D. המתאם בין שני סטים של נתוני הדמיה, דימות אופטי ואלקטרוני הדמיה, הושג באמצעות שלב מיקרוסקופ אור cryo-הקרינה בבנייה עצמית. הגישה המפורטת כאן תהיה בעל ערך, לא רק למחקר של אינטראקציות תא מארח, וירוס, אלא גם עבור יישומים רחבים יותר בביולוגיה של תא, כגון, סחר בקולט קרום תא איתות, ועוד רבים תהליכים תאיים דינמיים אחרים. </ P>
Introduction
Cryo-אלקטרון טומוגרפיה (cryoET) היא טכניקת הדמיה רב עוצמה המאפשרת הדמיה (3D) תלת ממדית של תאים ורקמות ומספקת תובנות לארגון של האברונים ילידים ומבנים הסלולר ברזולוציה מולקולרית למצב פיסיולוגי קרוב 1. עם זאת, בניגוד מיסוד הנמוך של דגימה קפוא התייבשות בלא כתם, בשילוב עם הרגישות לקרינה שלהם, הופך אותו לקשה לאתר תחומי העניין בתוך תא, ולאחר מכן ביצוע סדרת ההטיה בהצלחה מבלי לפגוע באזור היעד. על מנת להתגבר על בעיות אלה, גישה מצטרפת שמשלבת מיקרוסקופ אור ואלקטרונים היא הכרחית. תכונות ספציפיות מודגשות על ידי ניאון תיוג מזוהים וממוקמות על ידי מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי, ולאחר מכן את הקואורדינטות שלהן מועברות למיקרוסקופ האלקטרונים לרכישת נתונים 3D מבניים ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מסייעת גומלת איתור היעדreas של עניין לטפל. בשל הגבלה על עובי מדגם עם cryoEM (<300 ננומטר), כיום רק את אזורי הפריפריה של התא מתאימים לניתוח מבנים על ידי 3D CryoET. בהמשך הפחתת העובי של דגימות קפוא hydrated על ידי זגוגית חתך 8 או על ידי cryo-אלומת יונים ממוקד (FIB) טחינה 9 הייתי להרחיב את היכולת של הדמיה גומלת.
בעבר, שיטות גומלות היו בשימוש בעיקר כדי להקל על רכישת cryoET נתונים למבנים גדולים וסטטי 10-13. במחקרים אלה, cryo-שלבים יושמו לקבל רשתות cryoEM ולהתאים אותו גם מיקרוסקופ זקוף או מיקרוסקופ הפוכה 10,11,14. למרות מיתוג רשתות נראה פשוט למדי בעיצובים שלהם, יש העברה נוספת מעורבים לרשת EM צעדים, מגדיל את הסיכוי שהרשת עשויה להיות מעוות, פגומות ומזוהמת. לאחרונה הפגינו התקדמות טכנית במיקרוסקופיה המצטרפת שמאפשרת לנו לדמיין באופן ישיר אירועים דינמיים במהותם קשה לתפוס, כגון אינטראקציות תא מארחות HIV-1 ובשלבים מוקדמים של זיהום 15. אנחנו עשינו זאת על ידי תכנון ויישום שלב מדגם מיקרוסקופיה קריו אור שמתאים את עצמו מערכת מחסנית כדי למזער את נזק הדגימה עקב טיפול רשת, ובכך להקל מתאם. העיצוב שלנו כולל בעל מחסנית דגימה משולב, המאפשר גם מיקרוסקופיה קריו האור ואלקטרוני cryo-להתבצע, ברצף, באותו בעל דגימה, ללא העברת דגימה, ובכך לייעל את תהליך ההיווצרות. בנוסף, אנחנו גם יישמנו הליך התאמה מדויקת ואמין באמצעות חרוזים לטקס ניאון כסמני fiducial.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו הצגנו סדרה פשוטה של פרוטוקולים כדי לספק גישה גומלת מתקדמת כדי לנתח את האירועים הסלולר דינמיים באמצעות זמן לשגות הדמיה confocal, לחיות תאי הקרינה ואחרי cryoET. ההתפתחות המתודולוגית שלנו כדי לתאם לחיות תאי ההדמיה 3D עם cryoET ברזולוציה גבוהה היא קריטית כדי לחקור בעיות ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לטראוויס וילר ומכונת חנות במחלקה לביולוגיה של תא ופיזיולוגיה, אוניברסיטת פיטסבורג לבניית שלב מדגם cryo-הקרינה, Changlu טאו ונג שו באוניברסיטה למדע והטכנולוגיה של סין לטכנית סיוע, וד"ר תרזה Brosenitsch לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות (GM082251 & GM085043).
Materials
| Reagents | |||
| DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine | Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA | 12-604F | |
| Fibronectin | Sigma, St. Louis, MO | F1141-1MG | HeLa cell culture on EM grids |
| Cell tracker | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | C34552 | Red CMTPX |
| Protein A gold conjugates | Ted Pella, Inc., Redding, CA | 15822-1 | 15 nm diameter |
| 0.2 μm fluorescent microspheres | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | F8811 | Yellow-green fluorescent |
| Heat-inactivated fetal calf bovine serum | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 10082-139 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 15140-122 | |
| Glass-bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Gold quantifoil finder EM grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | R2/2 Au NH2 200 mesh | |
| PBS | Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA | 70011-044 | |
| Equipment | |||
| Glow-discharge device 100X | EMS, Hatfield, PA | ||
| Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | 300 keV | |
| Vitrobot Mark III | FEI, Hillsboro, OR | ||
| Olympus IX 71 microscope | Olympus America Inc., Center Valley, PA | LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens | |
| Nikon TiE microscope | Nikon Instruments, Melville, NY | using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens | |
| Sweptfield confocal microscope | Prairie Technologies, Middleton, WI | ||
| Tokai Hit live cell chamber | Tokyo, Japan | ||
| Cryo-fluorescence sample stage | Home-made | Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design. |
Riferimenti
- Leis, A., Rockel, B., Andrees, L., Baumeister, W. Visualizing cells at the nanoscale. Trends in Biochemical Sciences. 34, 60-70 (2009).
- Maurer, U. E., Sodeik, B., Grunewald, K. Native 3D intermediates of membrane fusion in herpes simplex virus 1 entry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10559-10564 (2008).
- McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. The Journal of Cell Biology. 159, 441-452 (2002).
- Arhel, N., et al. Quantitative four-dimensional tracking of cytoplasmic and nuclear HIV-1 complexes. Nature Methods. 3, 817-824 (2006).
- Gousset, K., et al. Real-time visualization of HIV-1 GAG trafficking in infected macrophages. PLoS Pathogens. 4, e1000015 (2008).
- Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
- Koch, P., et al. Visualizing fusion of pseudotyped HIV-1 particles in real time by live cell microscopy. Retrovirology. 6, 84 (2009).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the chemotaxis receptor Tsr. Journal of Microscopy. 216, 76-83 (2004).
- Wang, K., Strunk, K., Zhao, G., Gray, J. L., Zhang, P. 3D structure determination of native mammalian cells using cryo-FIB and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 180, 318-326 (2012).
- Sartori, A., et al. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 160, 135-145 (2007).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. Journal of Microscopy. 227, 98-109 (2007).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. European Journal of Cell Biology. 88, 669-684 (2009).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology. 172, 169-179 (2010).
- Gruska, M., Medalia, O., Baumeister, W., Leis, A. Electron tomography of vitreous sections from cultured mammalian cells. Journal of Structural Biology. 161, 384-392 (2008).
- Jun, S., et al. Direct visualization of HIV-1 with correlative live-cell microscopy and cryo-electron tomography. Structure. 19, 1573-1581 (2011).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Molecular Biology of the Cell. 13, 1977-2000 (2002).
- Agronskaia, A. V., et al. Integrated fluorescence and transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 164, 183-189 (2008).
- Marko, M., Hsieh, C., Schalek, R., Frank, J., Mannella, C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods. 4, 215-217 (2007).
