मधुमेहजनक सीडी 4 की दत्तक स्थानांतरण से चूहे में त्वरित टाइप 1 मधुमेह प्रेरण + टी कोशिकाओं
Summary
हम आइलेट विशिष्ट प्रतिजन, प्राथमिक सीडी 4 + टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण से दो सप्ताह के भीतर चूहों में टाइप 1 मधुमेह (T1D) उत्पन्न करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करते हैं.
Abstract
nonobese मधुमेह (इशारा) माउस अनायास उम्र के 12 सप्ताह के बाद autoimmune मधुमेह विकसित और मानव टाइप 1 मधुमेह (T1D) के सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन पशु मॉडल है. विकिरणित प्राप्तकर्ता चूहों में सेल हस्तांतरण पढ़ाई टी कोशिकाओं के इस मॉडल में T1D रोगजनन में निर्णायक हैं कि स्थापना की है. हम तेजी से शुद्ध के दत्तक हस्तांतरण द्वारा T1D प्रेरित करने के साथ साथ एक सरल विधि का वर्णन है, प्राथमिक सीडी 4 + NOD.SCID प्राप्तकर्ता चूहों में आइलेट विशेष टी सेल रिसेप्टर (TCR) BDC2.5 के लिए ट्रांसजेनिक पूर्व मधुमेह इशारा चूहों से टी कोशिकाओं. इस तकनीक का प्रमुख लाभ एक ही दिन के भीतर, प्राप्तकर्ताओं की विकिरण की आवश्यकता नहीं है, और T1D के एक उच्च घटना के टी सेल स्थानांतरण के बाद 2 सप्ताह के भीतर हासिल है मधुमेहजनक टी कोशिकाओं के अलगाव और दत्तक हस्तांतरण पूरा किया जा सकता है कि कर रहे हैं. इस प्रकार, T1D में रोगजनन और उपचारात्मक उपायों की पढ़ाई heterogenous टी सेल आबादी या क्लोन पर निर्भर है कि तरीकों के साथ तुलना में एक तेज दर से आगे बढ़ सकते हैंमधुमेह इशारा चूहों से ली गई.
Introduction
इशारा माउस अनायास autoimmune मधुमेह विकसित करता है और व्यापक रूप से मानव T1D 1,2 के लिए एक पशु मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है. इशारा चूहों में T1D के रोगजनन टी और बी कोशिकाओं द्वारा पीछा वृक्ष के समान कोशिकाओं और मैक्रोफेज द्वारा Langerhans की अग्नाशय islets, की, उम्र के 3-4 सप्ताह में शुरू, घुसपैठ की विशेषता है. गैर विनाशकारी पेरी insulitis के इस चरण में 3 साल की उम्र के 4-6 महीनों से प्रकट मधुमेह, जिसके परिणामस्वरूप में इंसुलिन के उत्पादन अग्नाशय β कोशिकाओं की एक धीमी, प्रगतिशील विनाश की ओर जाता है. 4,5 splenocytes, सीडी 4 + मधुमेह इशारा चूहों से 6,7 या सीडी 8 + 8,9 टी कोशिकाओं का स्थानांतरण आइलेट प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं T1D रोगजनन में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं, यह दर्शाता है immunocompromised इशारा चूहों में मधुमेह मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है. प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करता है, मधुमेह इन अध्ययनों में कई हफ्तों से अधिक, धीरे प्राप्तकर्ता चूहों में विकसित किया है. इसी प्रकार, विभिन्न टी सेल क्लोन, समय लेने वाली और महंगा द्वारा निकाली गईमधुमेहजनक टी कोशिकाओं के संवर्धन, कई हफ्तों प्राप्तकर्ता चूहों 7,10 में स्थानांतरण के बाद मधुमेह मध्यस्थता करने के लिए सूचित किया गया है. सीडी 4 या सीडी 8 प्रतिबंधित मधुमेहजनक टी सेल क्लोन, कई प्रयोगशालाओं से व्युत्पन्न TCRs व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों की उपलब्धता के साथ बाद में इस तरह के चूहों से प्लीहा टी कोशिकाओं 11-13 प्राप्तकर्ताओं को मधुमेह स्थानांतरण करने में सक्षम थे कि पता चला है. विशेष रूप से, BDC2.5 इशारा चूहों Chromogranin ए, अग्नाशय बीटा कोशिकाओं 14-16 में एक प्रोटीन के लिए विशिष्ट है जो BDC2.5 TCR, के लिए ट्रांसजेनिक हैं. इन विट्रो सक्रिय या क्षमता 11,17-19 अलग नवजात या immunodeficient इशारा चूहों को मधुमेह का तबादला खुलकर मधुमेह या prediabetic BDC2.5 चूहों से संयुक्त राष्ट्र के सक्रिय पूरे या fractionated तिल्ली कोशिकाओं का स्थानांतरण.
हम शुद्ध ट्रांसजेनिक सीडी 4 का उपयोग एक साधारण विधि + उच्च दक्षता और consiste पर प्राप्तकर्ता चूहों में T1D प्रेरित करने के लिए पूर्व मधुमेह BDC2.5 चूहों से टी कोशिकाओं का वर्णनncy. भोली, आइलेट प्रतिजन विशेष सीडी 4 + टी कोशिकाओं की संख्या में सीडी 4 के लिए प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) ट्रांसजेनिक TCR Vβ4 श्रृंखला व्यक्त + CD62L + टी कोशिकाओं द्वारा इन चूहों से अलग कर रहे हैं. शुद्ध ट्रांसजेनिक टी कोशिकाओं को फिर कार्यात्मक टी और बी कोशिकाओं की कमी है और insulitis और मधुमेह से मुक्त 20 हैं जो NOD.SCID चूहों में सक्रियण के बिना स्थानांतरित कर रहे हैं. प्राप्तकर्ता चूहों टी सेल स्थानांतरण के बाद दो सप्ताह के भीतर तेजी से विकसित होता है, जो T1D, यह दर्शाता है मूत्र ग्लूकोज का ऊंचा सांद्रता के लिए निगरानी कर रहे हैं.
Heterogenous specificities के मधुमेहजनक टी कोशिकाओं स्थानांतरण, हमारे प्रोटोकॉल FACS हल सीडी 4 + लगभग विशेष मधुमेहजनक BDC2.5 TCR व्यक्त कि टी कोशिकाओं का उपयोग करता है कि अन्य विधियों के विपरीत. उनकी एकरूपता के कारण, हस्तांतरित टी कोशिकाओं (~ 1×10 6 कोशिकाओं / माउस) की ही छोटी संख्या 100% घटना में 2 सप्ताह के भीतर तेजी से T1D विकास के लिए आवश्यक हैं. हमारे प्रोटोकॉल का एक अन्य लाभ यह है कि irradiatio हैप्राप्तकर्ता चूहों के n यह कुछ अन्य तरीकों के लिए है के रूप में आवश्यक नहीं है. इस पद्धति का एक संभावित सीमा है कि यह दोनों CD4 और CD8 टी सेल सबसेट या विशेष रूप से मधुमेह में CD8 टी कोशिकाओं के योगदान की जांच की अनुमति नहीं देता है.
वर्णित प्रोटोकॉल लक्ष्य अंग को आइलेट प्रतिजन विशेष गु कोशिकाओं के घर वापस आना में हस्तक्षेप करने के लिए भोले, monospecific सीडी 4 + टी कोशिकाओं, साथ ही चिकित्सीय रणनीतियों द्वारा मध्यस्थता तेजी T1D विकास, अध्ययन के लिए उपयोगी हो जाएगा.
Protocol
Representative Results
Discussion
T1D मधुमेह इशारा चूहों या मधुमेहजनक टी सेल क्लोन से व्युत्पन्न TCRs के लिए ट्रांसजेनिक चूहों से पूरे तिल्ली कोशिकाओं या टी सेल सबसेट के दत्तक हस्तांतरण द्वारा क्षमता अलग प्राप्तकर्ता चूहों में प्रेरित क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डीआरएस धन्यवाद. सहायक टिप्पणियों के लिए रॉबर्ट BONNEAU और नील क्रिस्टेंसेन.
इस काम के चिकित्सा धन के पेनसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी कॉलेज द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
Riferimenti
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