Accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici
Summary
Noi forniamo un metodo riproducibile per indurre il diabete di tipo 1 (T1D) nei topi entro due settimane dal trasferimento adottivo di isolotto antigene-specifiche, CD4 + cellule T primarie.
Abstract
Il diabetico (NOD) topo non obesi sviluppa spontaneamente il diabete autoimmune dopo 12 settimane di età ed è il modello animale più studiato di umani di tipo 1 diabete (T1D). Studi trasferimento di cellule in topi riceventi irradiati hanno stabilito che le cellule T sono fondamentali nella patogenesi T1D in questo modello. Descriviamo qui un metodo semplice per indurre rapidamente T1D dal trasferimento adottivo di purificato, CD4 + cellule T primarie di pre-diabetici topi NOD transgenici per il recettore delle cellule T isolotto-specifica (TCR) BDC2.5 in topi riceventi NOD.SCID. I principali vantaggi di questa tecnica sono che isolamento e trasferimento adottivo di cellule T diabetogene può essere completato entro il giorno stesso, non è richiesta irradiazione dei destinatari, e una elevata incidenza di T1D è suscitato entro 2 settimane dopo il trasferimento delle cellule T. Così, gli studi di patogenesi e di interventi terapeutici nel diabete di tipo 1 possono avvenire a un ritmo più veloce rispetto ai metodi che si basano su eterogenee popolazioni di cellule T o cloniderivato da topi NOD diabetici.
Introduction
Topo NOD sviluppa diabete autoimmune spontaneo ed è stato ampiamente utilizzato come modello animale per 1,2 T1D umana. Patogenesi del diabete di tipo 1 nei topi NOD è caratterizzata da infiltrazione, con inizio alle 3-4 settimane di età, delle isole pancreatiche di Langerhans da parte delle cellule dendritiche e macrofagi, seguiti da cellule T e B. Questa fase di non distruttiva peri-insulitis porta ad una lenta, progressiva distruzione delle cellule che producono insulina β pancreatiche, con conseguente diabete manifesto da 4-6 mesi di età 3. Trasferimento di splenociti 4,5, CD4 + 8,9 + 6,7 o cellule CD8 T da topi NOD diabetici hanno dimostrato di mediare il diabete nei topi NOD immunocompromessi, il che indica che le cellule T isolotto-reattive giocano un ruolo centrale nella patogenesi T1D. A seconda delle condizioni sperimentali, diabete sviluppato in topi riceventi lentamente, nell'arco di diverse settimane in questi studi. Analogamente, vari cloni di cellule T, derivato dal tempo e costosocoltura di cellule T diabetogenici, sono stati segnalati per mediare diabete diverse settimane dopo il trasferimento in topi riceventi 7,10. Con la disponibilità di topi transgenici che esprimono TCR derivati da CD4-o cloni di cellule CD8-restricted diabetogenici T, diversi laboratori hanno successivamente dimostrato che le cellule T spleniche di questi topi sono stati in grado di trasferire il diabete ai destinatari 11-13. Specificamente, BDC2.5 topi NOD sono transgenici per la BDC2.5 TCR, che è specifico per cromogranina A, una proteina nelle cellule beta pancreatiche 14-16. Trasferimento di in vitro-attivato o cellule della milza interi o frazionati non-attivati dal apertamente diabetici o prediabetico BDC2.5 topi trasferiti diabete di topi NOD neonatali o immunodeficienti a varie efficienze 11,17-19.
Descriviamo un metodo semplice che utilizza CD4 transgenici purificate + cellule T dei pre-diabetici BDC2.5 topi per indurre diabete di tipo 1 in topi riceventi ad alta efficienza e ConsisteNCY. Un gran numero di ingenui, isolotto CD4 antigene-specifiche cellule T sono isolati da questi topi di selezione delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS) per CD4 + CD62L + cellule T che esprimono il TCR catena Vβ4 transgenico. Cellule purificate transgeniche T sono poi trasferiti senza attivazione in topi NOD.SCID, che mancano funzionale T e le cellule B e sono insulitis-e diabete-libero 20. I topi riceventi sono monitorati per elevate concentrazioni di glucosio nelle urine che indicano diabete di tipo 1, che si sviluppa rapidamente nel giro di due settimane dopo il trasferimento di cellule T.
A differenza di altri metodi che trasferire le cellule T diabetogene con specificità eterogenee, il nostro protocollo utilizza FACS-ordinati cellule T CD4 + che esprimono quasi esclusivamente il diabetogeno BDC2.5 TCR. A causa della loro omogeneità, solo un piccolo numero di cellule T trasferite (~ 1×10 6 cellule / topo) sono necessari per un rapido sviluppo T1D entro 2 settimane al 100% di incidenza. Un altro vantaggio di questo protocollo è che irradiation di topi riceventi non è necessaria come lo è per alcuni altri metodi. Un potenziale limite di questo metodo è che non consente l'indagine sul contributo di entrambi CD4 e CD8 sottoinsiemi di cellule T CD8 o specificamente cellule T nel diabete.
Il protocollo descritto sarà utile per lo studio di un rapido sviluppo diabete di tipo 1, mediata da ingenui, monospecifici CD4 + cellule T, così come le strategie terapeutiche per intervenire in homing di antigene-specifiche cellule Th isolotto per l'organo bersaglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
T1D può essere indotta in topi riceventi a varie efficienze di trasferimento adottivo di cellule della milza intere o sottoinsiemi di cellule T da topi NOD diabetici o topi transgenici per il TCR derivati da cloni di cellule T diabetogenici. Riportiamo qui un metodo riproducibile per indurre il diabete di tipo 1 in topi riceventi entro due settimane al 100% di incidenza con il trasferimento di FACS-purificati CD62L + BDC2.5 CD4 transgenici cellule T nei topi NOD.SCID.
Vantaggi specifi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Drs. Robert Bonneau e Neil Christensen per gli utili commenti.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Pennsylvania State University College of Medicine fondi.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
Riferimenti
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