Ускоренное диабета 1 типа у мышей Индукционная приемными Передача диабетогенные CD4 + Т-клеток
Summary
Мы предоставляем воспроизводимый метод, чтобы вызвать сахарный диабет 1 типа (СД-1) у мышей в течение двух недель от приемных передачи островок антиген-специфические, первичные CD4 + Т-клеток.
Abstract
Без ожирения диабетические (NOD) мышей спонтанно развивается аутоиммунный диабет после 12-недельного возраста и является наиболее широко изучены животную модель человеческого диабета 1 типа (СД-1). Сотовые передачи исследований в облученных мышей получатель будет установлено, что Т-клетки играют ключевую роль в патогенезе СД-1 в этой модели. Мы описываем здесь простой способ быстро индуцируют T1D приемными передача очищенной, первичные CD4 + Т-клеток из предварительно диабетической NOD трансгенных мышей для островка-специфических Т-клеточный рецептор (TCR) BDC2.5 в NOD.SCID мышей получателя. Основные преимущества этого метода в том, что изоляция и приемных передачи диабетогенные Т-клеток может быть завершена в течение одного дня, облучение получателей не требуется, и высокая частота T1D поведения возникает в течение 2 недель после переноса Т-клеток. Таким образом, исследования патогенеза и терапевтических вмешательств при СД1 может протекать с большей скоростью, чем с методами, которые полагаются на гетерогенные популяции Т-клеток или клоны, полученных из диабетических мышей NOD.
Introduction
NOD мышей развивается аутоиммунный диабет спонтанно и широко используется в качестве животной модели для человеческого СД-1 1,2. Патогенез СД-1 в NOD мышей характеризуется инфильтрацией, начиная с 3-4 недель, в панкреатических островках Лангерганса дендритными клетками и макрофагами, после чего Т-и В-клеток. Эта фаза неразрушающего пригородных инсулитом приводит к медленному, прогрессирующим разрушением инсулин-продуцирующие клетки поджелудочной железы β, в результате чего явным диабетом в 4-6 месячном возрасте 3. Передача спленоцитов 4,5, 6,7 CD4 + или CD8 + 8,9 Т-клеток от диабетических мышей NOD было показано, что промежуточный диабета у мышей NOD с ослабленным иммунитетом, указывая, что островок-реактивные Т-клетки играют центральную роль в патогенезе СД-1. В зависимости от условий эксперимента, диабет разработаны в мышей-реципиентов медленно, в течение нескольких недель в этих исследованиях. Кроме того, различные клоны Т-клеток, полученных трудоемким и дорогостоящимкультивирование диабетогенные Т-клеток, как сообщается, посредником диабета через несколько недель после перевода на мышей-реципиентов 7,10. При наличии трансгенных мышей, экспрессирующих TCR, полученных из CD4-CD8 или ограничением диабетогенные клонов Т-клеток, несколько лабораторий впоследствии показали, что Т-клетки селезенки от таких мышей были в состоянии передавать диабетом получателям 11-13. В частности, BDC2.5 мышей NOD являются трансгенными для BDC2.5 TCR, которая является специфической для хромогранином, белка в бета-клетки поджелудочной железы 14-16. Передача в пробирке активированный или ООН-активированной полностью или фракционированного клетки селезенки открыто диабетическая или преддиабетом BDC2.5 мышей передаются диабет новорожденных или иммунодефицитных мышей NOD с разной эффективностью 11,17-19.
Опишем простой метод, который использует очищенную трансгенных CD4 + Т-клеток от преддиабетическом BDC2.5 мышей, чтобы вызвать T1D в мышей-реципиентов при высокой эффективности и consisteNCY. Большие количества наивных, островок антиген-специфических CD4 + Т-клетки выделяют из этих мышей с активацией флуоресценции сортировки клеток (FACS) для CD4 + CD62L + Т-клеток, экспрессирующих TCR трансгенных Vβ4 цепи. Очищенный трансгенных Т-клетки, которые затем передаются без активации в NOD.SCID мышей, у которых отсутствует функциональный Т-и В-клеток и инсулитом и диабет без 20. Мышей-реципиентов контролируются на повышенных концентраций глюкозы в моче указывает T1D, которая быстро развивается в течение двух недель после перевода T клетки.
В отличие от других методов, которые передают диабетогенные Т-клеток с гетерогенной особенностей, наш протокол использует FACS отсортированные CD4 + Т-клеток, которые почти исключительно выразить диабетогенные BDC2.5 TCR. Благодаря своей однородности, только небольшое количество Т-клеток передается (~ 1×10 6 клеток / мышь) необходимы для быстрого развития СД-1 в течение 2 недель в 100% случаев. Еще одно преимущество нашего протокола является то, что irradiatioп мышей-реципиентов не является необходимым, так и для некоторых других методов. Потенциальным ограничением этого метода является то, что она не позволяет расследование вклад как CD4 и CD8 Т-клетки или подмножества специально CD8 Т-клеток при диабете.
Описанный протокол будет полезна для изучения быстрых T1D развитие, опосредовано наивный, моноспецифическую CD4 + Т-клеток, а также терапевтических стратегий вмешиваться в самонаведения островковых антиген-специфические клетки Th к органу-мишени.
Protocol
Representative Results
Discussion
СД-1 может быть индуцирован в мышей-реципиентов с различной эффективностью по приемных передачи целых клеток селезенки или Т-клетки из подмножества диабетических мышей NOD или трансгенных мышей для TCR, полученный из сахарного диабета клеточных клонов Т. Мы сообщаем здесь воспроизводимы…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра. Роберт Бонно и Нил Кристенсен за полезные комментарии.
Эта работа выполнена при поддержке Университета штата Пенсильвания Медицинского колледжа средств.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
Riferimenti
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
- Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
- Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
- Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
- Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
- Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
- Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
- Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
- Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
- Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
- Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
- Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
- Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
- Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
- Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).
