Akselerert Type 1 Diabetes Induksjon i Mus ved Adoptive Overføring av diabetogenic CD4 + T celler
Summary
Vi tilbyr en reproduserbar metode for å indusere type 1 diabetes (T1D) i mus innen to uker etter at adoptiv overføring av holmen antigen-spesifikke, primære CD4 + T celler.
Abstract
Den nonobese diabetiker (NOD) mus utvikler spontant autoimmune diabetes etter 12 ukers alder og er den mest omfattende studert dyremodell av menneskelig Type 1 diabetes (T1D). Cell overføre studier i bestrålte mottaker mus har fastslått at T-cellene er sentrale virkemidler T1D patogenesen i denne modellen. Vi beskriver her en enkel metode for å raskt gi muligheter T1D av adoptiv overføring av renset, primære CD4 + T celler fra pre-diabetes NOD mus transgene for holmen-spesifikke T-celle reseptor (TCR) BDC2.5 inn NOD.SCID mottaker mus. De største fordelene med denne teknikken er at isolasjon og adoptiv overføring av diabetogenic T-celler kan gjennomføres innen samme dag, er bestråling av mottakerne ikke nødvendig, og en høy forekomst av T1D er fremkalte innen to uker etter at T celle overføring. Dermed kan studier av patogenese og terapeutiske intervensjoner i T1D fortsette i et raskere tempo enn med metoder som er avhengige av heterogene T celle populasjoner eller kloneravledet fra diabetiske NOD mus.
Introduction
Den NOD mus utvikler autoimmune diabetes spontant og har vært mye brukt som en dyremodell for human T1D 1,2. Pathogenesis av T1D i NOD mus er preget av infiltrasjon, som begynner ved 3-4 ukers alder, av bukspyttkjertelen holmer av Langerhans av dendrittiske celler og makrofager, etterfulgt av T og B-celler. Denne fasen av ikke-destruktiv peri-insulitis fører til en langsom, progressiv ødeleggelse av insulin-produserende bukspyttkjertelen β-celler, noe som resulterer i overt diabetes ved 4-6 måneders alder tre. Overføring av splenocytes 4,5, CD4 + 6,7 eller CD8 + 8,9 T celler fra diabetiske NOD mus har vist seg å megle diabetes hos immunsupprimerte NOD mus, noe som indikerer at holme-reaktive T-celler spiller en sentral rolle i T1D patogenesen. Avhengig av eksperimentelle forhold, utviklet diabetes i mottakerlandene mus sakte, over flere uker i disse studiene. Tilsvarende ulike T-celle kloner, avledet av tidkrevende og kostbaredyrking av diabetogenic T-celler, har blitt rapportert å megle diabetes flere uker etter overføring til mottaker mus 7,10. Med tilgjengeligheten av transgene mus som uttrykker TCR avledet fra CD4-eller CD8-restricted diabetogenic T-celle kloner, flere laboratorier har i ettertid vist at spleniske T-celler fra slike mus var i stand til å overføre diabetes til mottakere 11-13. Spesielt BDC2.5 NOD mus er transgene for BDC2.5 TCR, som er spesifikk for kromogranin A, et protein i betaceller i bukspyttkjertelen 14-16. Overføring av in vitro-aktivert eller un-aktiverte hele eller fraksjonert miltceller fra åpenlyst diabetiker eller prediabetic BDC2.5 mus overført diabetes til nyfødte eller immunodeficient NOD mus ved varierende effektivitet 11,17-19.
Vi beskriver en enkel metode som benytter renset transgene CD4 + T celler fra pre-diabetes BDC2.5 mus å indusere T1D i mottakerlandene mus med høy effektivitet og consisteNCY. Et stort antall naive, holmen antigen-spesifikke CD4 + T celler er isolert fra disse musene av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) for CD4 + CD62L + T celler som uttrykker transgene TCR Vβ4 kjeden. Renset transgene T-celler blir deretter overført uten aktivering inn NOD.SCID mus, som mangler funksjonelle T-og B-celler og er insulitis-og diabetes-fri 20.. Mottakeren mus overvåkes for forhøyede konsentrasjoner av urin glukose indikerer T1D, som utvikler seg raskt innen to uker etter at T-celle overføring.
I motsetning til andre metoder som overfører diabetogenic T-celler med heterogene særegenheter, bruker vår protokoll FACS-sortert CD4 + T celler som nesten utelukkende uttrykker diabetogenic BDC2.5 TCR. På grunn av homogenitet deres, er bare et lite antall overførte T-celler (~ 1×10 6 celler / mus) som kreves for rask T1D utvikling innen 2 uker med 100% insidens. En annen fordel med protokollen vår er at irradiation av mottaker-mus er ikke nødvendig, fordi det er for enkelte andre metoder. En potensiell begrensning med denne metoden er at den ikke tillater etterforskningen av bidrag fra både CD4 og CD8 T-celle undergrupper eller spesielt CD8 T-celler i diabetes.
Den beskrevne protokollen vil være nyttig for å studere rask T1D utvikling, formidlet av naive, monospesifikke CD4 + T celler, samt terapeutiske strategier for å gripe inn i homing av holmen antigen-spesifikke Th celler til målorganet.
Protocol
Representative Results
Discussion
T1D kan induseres i mottakerlandene mus med varierende effektivitet ved adoptiv overføring av hele milt celler eller T-celle undergrupper fra diabetiske NOD mus eller mus transgene for TCR avledet fra diabetogenic T-celle kloner. Vi rapporterer her en reproduserbar metode for å indusere T1D i mottakerlandene mus i løpet av to uker på 100% insidens ved å overføre FACS-rensede CD62L + BDC2.5 transgene CD4 + T celler i NOD.SCID mus.
Spesifikke fordeler ved BDC2.5 T-celle overføring model…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker legene. Robert Bonneau og Neil Christensen for nyttige kommentarer.
Dette arbeidet ble støttet av Pennsylvania State University College of Medicine midler.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5) | JAX | 004460 | |
| NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J) | JAX | 001303 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Themo Scientific | SH30022.01 | |
| Bayer Diastix | Fisher Scientific | AM2803 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 70 μm cell strainers | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer | 0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O | ||
| BD FACSFlowTM sheath fluid | BD Biosciences | 342003 | |
| FACS staining buffer | PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter sterilized | ||
| Phase contrast microscope | |||
| Trypan blue | |||
| Hemocytometer | |||
| Anti-CD4 (APC) mAb | Biolegend | 1005616 | clone RM4-5 |
| Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb | BD Biosciences | 553365 | clone KT4 |
| Anti-CD62L (PE) mAb | BD Biosciences | 553151 | clone MEL-14 |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD FACSAria III | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 18-1½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305196 | |
| 27½ gauge needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
Riferimenti
- Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
- Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
- Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
- Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
- Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
- Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
- Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
- Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
- Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
- Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
- Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
- Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
- Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
- Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
- Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
- Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).
