Implementera Dynamic Clamp med Synaptic och artificiella konduktanser i Mus Retinal ganglion celler
Summary
Denna video artikeln illustrerar set-up, förfaranden för att lappa cell organ och hur att genomföra dynamiska clamp inspelningar från ganglion celler i hela montera mus retinae. Denna teknik gör det möjligt att utreda den exakta bidrag retande och hämmande synaptiska ingångar, och deras relativa storlek och timing till neuronal spiking.
Abstract
Ganglionceller är de utgående nervceller i näthinnan och deras aktivitet återspeglar integrering av flera synaptiska inmatningar som rör specifika neurala kretsar. Patch clamp teknik, i spänningsklämma och aktuella konfigurationer klämma, används ofta för att studera de fysiologiska egenskaperna hos nervceller och att karaktärisera sina synaptiska ingångar. Även om tillämpning av dessa tekniker är mycket informativ, utgör de olika begränsningar. Till exempel är det svårt att kvantifiera hur de exakta samspelet mellan retande och hämmande insatsvaror bestämmer svar utgång. För att lösa detta har vi använt en modifierad strömtång teknik, dynamisk klämma, även kallad konduktans klämma 1, 2, 3 och undersökt effekterna av excitatoriska och inhibitoriska synaptiska ingångar på neuronala retbarhet. Denna teknik kräver injektion av ström in i cellen och är beroende av den feedback i realtid av sin membranpotential vid den tidpunkten. Den injected ström beräknas från förutbestämda retande och hämmande synaptiska konduktanser, deras potentialer återföring och cellens momentana membran potential. Detaljer om de experimentella procedurer, patch fastspänning celler för att uppnå en hel-cell konfiguration och sysselsättning av den dynamiska klämman tekniken illustreras i denna video artikeln. Här visar vi svaren från mus näthinneganglieceller till olika konduktans vågformer erhållna från fysiologiska experiment kontrollbetingelser eller i närvaro av droger. Dessutom visar vi användning av artificiella retande och hämmande konduktanser genererats med alfa-funktioner för att undersöka svaren i cellerna.
Introduction
Näthinnan är en nästan transparent nervvävnad foder baksidan av ögat. Många studier använder näthinnan som modell för att undersöka de första stegen i visuell bearbetning och mekanismer synaptiska signaleringen. Eftersom den retinal nätverket i hela montera beredning förblir intakt efter dissektion, innebär det ett idealiskt system för att studera synaptiska interaktioner som dess fysiologiska reaktioner är mycket lik den in vivo-betingelser. Således, med hjälp av en isolerad näthinnan egenskaper dess nervceller kan studeras med hjälp av tekniker patch clamp (för omdömen på tekniken, se 6,9,13). Identifiering av det exakta bidraget av specifika kretsar och signalsubstanser gangliecell svar, dock brukar hindras som farmakologiska medel verkar på olika platser.
Fysiologiska reaktioner av näthinnans nervceller för ljus, den naturliga stimulans, kan spelas in med glaspipetter fyllda med intracellulär vätska. Använda patch clamp tekniker, neuronala svar på ljus stimulering kan registreras som membran potentiella fluktuationer (strömtång) eller som strömmar (spänningsklämma). Genom att hålla membranet potentialen vid olika spänningar och genomföra en posteriori konduktans analys, är det möjligt att isolera hämmande och excitatoriska synaptiska ingångar 5,12. Denna typ av försök kan utföras i normalt badmedium och i närvaro av olika farmakologiska medel för att isolera bidraget från de olika neurotransmittorer och receptorer till neuronala responser. En uppsjö av studier från många laboratorier kännetecknas beroendet av tillsatta produktion och retande och hämmande ingångarna på stimulans egenskaper såsom storlek, kontrast, rumsliga och tidsmässiga frekvenser, riktning, orientering och andra variabler stimulanser. Även om dessa experimentella metoder ger information om förhållandet mellan spik produktion och synaptiska ingångar som en funktion av stimulans fastigheter,tolkning av bidraget av specifika celltyper och deras synaptiska ingångar till cellen retbarhet är inte okomplicerat. Detta beror på det faktum att vanligtvis både retande och hämmande insatsvaror varierar med stimulansåtgärder egenskaper och därmed är det inte möjligt att bedöma den exakta påverkan som förändringar i någon av dessa ingångar har på neuronal spiking.
Ett alternativt tillvägagångssätt för att kringgå dessa begränsningar är att utföra dynamiska clamp inspelningar, som möjliggör en kritisk utvärdering av bidragen till enskilda synaptiska ingångar till spiking utgång. Den dynamiska clamp teknik möjliggör direkt injektion av strömmen i cellen och mängden ström som matas vid en given tidpunkt beror på den inspelade membran potential på den tiden 1,2,3 (för översikt se 7,14). Det är en modifierad strömtång set-up där en realtid, snabba återkopplingskanalen växelverkan mellan cellen under inspelning och den utrustning som omfattar specialiserad hårdvara, mjukvaraoch en dator uppnås. Mängden ström som matas in i cellen beräknas i enlighet därmed. Följaktligen är fördelen med denna metod att cellen kan stimuleras med olika kombinationer av konduktans vågformer, och dess svar kommer att efterlikna aktivering av receptorer som medierar synaptiska inmatningar. Till exempel ger jämförelse av svaret på injektion av retande och hämmande konduktanser för en liten fläck med svaret till injektion av excitatoriska konduktans för en liten fläck bara information om hur hämning av cellens respons. Likaså kan andra kombinationer av fysiologiskt inspelade konduktanser vara co-injiceras för att avslöja hur stimulus-beroende förändringar av excitatoriska och / eller hämmande konduktanser påverkar spik utgång.
I vår studie, är den dynamiska klämman teknik som används för att visa på effekten av den relativa amplituden och timingen av synaptiska ingångar på skottlossningen egenskaper näthinneganglieceller. Olika konduktansererhållits från fysiologiska experiment i kontrollbetingelser eller i närvaro av farmakologiska medel användes som indata. Dessutom har artificiella konduktanser baserade på alfa-funktioner även användas för att undersöka hur synaptiska ingångar integreras av nervceller. Således är detta en mångsidig teknik som tillåter olika typer av konduktans antingen genereras fysiologiskt, farmakologiskt eller beräkningsmässigt att injiceras i samma ganglion cell, så kan jämförelse av svar på dessa insignaler göras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här visar vi användningen av dynamiska klämma för att bedöma inverkan av förhållandet och relativa timingen för excitation och hämning på näthinnegangliecell utgång. Dynamisk klämma använder datorsimuleringar för att införa fysiologiskt inspelade eller konstgjorda synaptiska konduktanser i levande nervceller. Denna metod ger ett interaktivt verktyg med vilket konduktanser kan modifieras och injiceras i nervceller för att beräkna deras påverkan på neurala reaktioner. Conductance vågformer kan erhåll…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av Australian Research Council (ARC DP0988227) och Biomedicinsk vetenskap Research Initiative Grant från Discipline of Biomedical Science, University of Sydney. Utrustningen Patch Clamp Förstärkare EPC 8 finansierades av Startup fonden från Discipline of Biomedical Science, University of Sydney. Utrustningen InstruTECH LIH 8 +8 Data Acquisition System köptes med medel från Rebecca L. Cooper Foundation och Startup fonden från Discipline of Biomedical Science, University of Sydney. Vi vill tacka de anonyma granskarna för deras insiktsfulla förslag och kommentarer.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
References
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -. S. . Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).
- Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
