माउस के आनुवंशिक हेरफेर के माध्यम से Hypothalamus का विकास<em> गर्भाशय में</em> Electroporation
Summary
हाइपोथेलेमस के कार्यात्मक और चिकित्सा महत्व के बावजूद,<em> Utero में</emइसके विकास के> आनुवंशिक हेरफेर शायद ही प्रयास किया गया है. हम के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया दिखाने<em> Utero में</emमाउस हाइपोथैलेमस और कुल और आंशिक (क्षेत्रीय) हाइपोथैलेमस अभिकर्मक के शो प्रतिनिधि परिणामों में> इलेक्ट्रोपोरेशन.
Abstract
विकासशील स्तनधारी मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों के आनुवंशिक संशोधन एक बहुत शक्तिशाली प्रयोगात्मक दृष्टिकोण है. हालांकि, उपन्यास माउस म्यूटेंट पैदा अक्सर frustratingly धीमी है. यह उचित बाद operatory अस्तित्व के साथ गर्भाशय में विकसित करने के लिए माउस मस्तिष्क के लिए उपयोग संभव है कि दिखाया गया है. फिर भी, इस प्रक्रिया के परिणाम विकासशील मस्तिष्क का सबसे सतही और आसानी से सुलभ भाग के लिए लगभग विशेष रूप से सूचित किया गया है, प्रांतस्था अर्थात्. चेतक, एक संकरा और अधिक औसत दर्जे का क्षेत्र, लक्ष्य और अधिक कठिन साबित हो गया है. विशेष रूप से गहरी नाभिक, हाइपोथैलेमस के उन लोगों में अभिकर्मक, सबसे चुनौतीपूर्ण और इसलिए बहुत कुछ परिणामों की सूचना दी गई है शायद है. यहाँ हम पूरे हाइपोथैलेमस neuroepithelium या electroporation के माध्यम से अभिकर्मक के लिए इसका हिस्सा (हाइपोथैलेमस) क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए एक प्रक्रिया का प्रदर्शन. हमारे दृष्टिकोण के लिए चाबी टी में अब निद्रावहन बार, इंजेक्शन हैंhird निलय, और उचित प्रकार और इलेक्ट्रोड की स्थिति. इसके अतिरिक्त, हम को लक्षित और सबसे धंसे हुए हाइपोथैलेमस नाभिक, mammillary शरीर के बाद ऊतकीय विश्लेषण के परिणाम दिखाते हैं.
Introduction
भ्रूण माउस मस्तिष्क के आनुवंशिक हेरफेर के विकास के विनियमन के बारे में जानने के लिए एक पसंदीदा तरीका है. उत्परिवर्ती माउस लाइनों की पीढ़ी हालांकि धीमी और महंगी है. स्तनधारी मस्तिष्क के न्यूरॉन्स के विकास में विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन शुरू करने के लिए एक शक्तिशाली विधि utero electroporation में है. मूलतः, तकनीक तो भ्रूण, समय की एक निश्चित अवधि के लिए जीवित रहने के दिमाग को इकट्ठा करने और संभव उपन्यास, जानकारीपूर्ण phenotypes के लिए उन्हें जांच के लिए अनुमति देने, बिजली के दालों के माध्यम से भ्रूण के मस्तिष्क neuroepithelium में डीएनए transfecting के होते हैं. इस तरह, प्रयोगकर्ता माउस म्यूटेंट के उत्पादन के लिए आवश्यक लंबी प्रतीक्षा अवधि के बिना लगभग तुरंत परिकल्पना परीक्षण कर सकते हैं.
विकासशील भ्रूण में डीएनए की अभिकर्मक लड़की भ्रूण 1 पर ओवो electroporation में के साथ शुरू कर दिया. माउस के लिए सबूत की अवधारणा आवश्यक संस्कृति में प्रदर्शन किया गया था <s2> ऊपर. यह जल्द ही गर्भ 3,4 में माउस पर तकनीक के पहले वर्णन किया गया.
मुख्य समस्या यह है कि उन्हें या मां की हत्या के बिना गर्भ में भ्रूण के विकास के मस्तिष्क transfect है. (Laparotomy, इंजेक्शन, इलेक्ट्रोपोरेशन) आवश्यक सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए सीखने की एक लंबी अवधि के प्रशिक्षण की आवश्यकता है. सर्जरी भ्रूण अस्तित्व अनुपात स्वीकार्य है इस मुद्दे पर जहां महारत हासिल हो जाने के बाद, अगले महत्वपूर्ण सवाल यह है कि मस्तिष्क संरचना सुलभ कर रहे हैं? आश्चर्य नहीं कि utero electroporation में साथ प्राप्त परिणामों दिखा पहले पत्र प्रकाशित कोर्टिकल विकास 5-9 पर जोर दिया. सर्जिकल प्रक्रियाओं के लिए सबसे सुलभ विकासशील माउस मस्तिष्क के क्षेत्र प्रांतस्था (चित्रा 1) है, क्योंकि यह इस तकनीक का उपयोग प्रकाशनों के अधिकांश के लिए भी सच है. प्रांतस्था में utero electroporation में के लिए प्रक्रिया का वर्णन किया गया हैप्रिंट 10 में और वीडियो 11-14 में. तकनीक का एक संशोधन telencephalon की एक उदर भाग, बेसल ganglia 15 को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Telencephalon परे, diencephalon (प्रतिष्ठित चेतक और हाइपोथेलेमस में विभाजित) तक पहुंचने के लिए और अधिक कठिन अग्रमस्तिष्क का एक क्षेत्र है. इसके पृष्ठीय और सबसे सुलभ हिस्सा, चेतक 16-19 को निशाना कागजात रिपोर्ट की एक छोटी संख्या.
हाइपोथैलेमस, अग्रमस्तिष्क की सबसे उदर हिस्सा है इसलिए एक पृष्ठीय सतह (प्रांतस्था) (चित्रा 1) से सबसे अधिक गहराई स्थानीयकृत. इस क्षेत्र में आनुवंशिक रूप से गर्भाशय में माउस मस्तिष्क में हेरफेर करने के लिए प्रतिबद्ध शोधकर्ताओं के लिए एक कठिन चुनौती बनी हुई है. हमारे ज्ञान करने के लिए, केवल बहुत कुछ लेख माउस हाइपोथेलेमस 20,21 में गर्भाशय अभिकर्मक में के परिणामों पर रिपोर्ट. हालांकि, हाइपोथैलेमस canno के कार्यात्मक महत्वयह, संभोग, प्रजनन और parenting 22 खाने और पीने की तरह व्यवहार को नियंत्रित करता है के बाद से टी, अतिरंजित किया. इसके अलावा, हाइपोथैलेमस विकास में परिवर्तन के बाद मोटापा, उच्च रक्तचाप, मधुमेह और असामयिक यौवन 23 की तरह जीवन स्थितियों में आरंभ करने के लिए योगदान करते हैं. विकास के दौरान आनुवंशिक हाइपोथेलेमस को बदलने में सक्षम होने के नाते इसे समझने के लिए एक बहुत शक्तिशाली उपकरण प्रदान करेगा.
हम यहाँ का उपयोग करें कि गर्भवती चूहों के laparotomy के लिए बुनियादी शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल अन्य प्रोटोकॉल 11,13,14,24 में प्रयुक्त के समान है. हम पूर्णता के लिए संक्षेप में उन्हें यहाँ का वर्णन करेंगे. हमारी प्रक्रिया की कुंजी, दूसरे हाथ पर, संज्ञाहरण के प्रकार, इंजेक्शन की जगह, इलेक्ट्रोड के प्रकार और सम्मिलन और भ्रूण के सिर के संबंध में सकारात्मक इलेक्ट्रोड की स्थिति में हैं. पूर्व के लिए अनुमति देता है के बाद से हम साधारण intraperitoneal संज्ञाहरण से अधिक गैस साँस लेना के माध्यम से संज्ञाहरण प्रेरित करने और बनाए रखने के लिए पसंद करते हैंनिद्रावहन की कुछ हद तक लंबी अवधि के लिए एक मुश्किल सर्जरी के लिए आवश्यक है. संज्ञाहरण से तेजी से वसूली में isoflurane साँस लेना परिणाम, आमतौर पर माँ पहले से ही सर्जरी के बाद मिनट के सामान्य व्यवहार को दर्शाता है. कांच micropipette के साथ डीएनए समाधान के इंजेक्शन के लिए सबसे आसान बिंदु हालांकि हाइपोथेलेमस electroporation के लिए पूरी तरह से अनुपयुक्त है जो पार्श्व वेंट्रिकल है. सीधे तीसरे निलय में इंजेक्शन वास्तव में गहरी diencephalic संरचनाओं को लक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह मानक, बंद-the-शेल्फ इलेक्ट्रोड के साथ E12.0 या E12.5 से हाइपोथेलेमस transfect करने के लिए संभव है. हम विशेष रूप से इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त नेपा जीन (चिबा, जापान) द्वारा निर्मित इलेक्ट्रोड के कुछ मिल गया है.
हमारी प्रक्रिया के साथ हम पूरी हाइपोथैलेमस neuroepithelium या इलेक्ट्रोड अभिविन्यास के आधार पर आंशिक, क्षेत्रीय अभिकर्मक के अभिकर्मक प्राप्त करते हैं. यहाँ हम यकीनन, mammillary शरीर transfecting द्वारा तकनीक का प्रदर्शनगहरे और सभी हाइपोथैलेमस नाभिक की सबसे धंसे हुए. इसके अतिरिक्त, हम संकल्प के सेलुलर स्तर तक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की विस्तृत ऊतकीय विश्लेषण नीचे दिखा.
Utero में माउस विकासशील मस्तिष्क transfecting के लिए अन्य तरीकों के साथ utero electroporation में की तुलना से चर्चा अनुभाग में पाया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
संज्ञाहरण के बारे में: हाइपोथेलेमस में utero electroporation में तकनीकी रूप से कठिन हो सकता है और लंबे समय तक निद्रावहन समय की आवश्यकता होती है सकते हैं, हम ऑक्सीजन और isoflurane के एक मिश्रण के प्रशासन के माध्यम से स…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम में जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (ड्यूश Forschungsgemeinschaft) द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| REAGENTS | |||
| Acepromazine | Sanofi GmbH | anesthetic | |
| Isoflurane | Baxter | HDG9623 | anesthetic |
| Ketamin | Pharma GmbH | anesthetic | |
| Fast Green | Fluka | 44715 | |
| Rimadyl | Pfizer | non-steroidal anti-inflammatory | |
| Braunoderm | Braun | 3887138 | povidone-iodine |
| Phosphate Buffer Saline PBS | Gibco | 14190 | |
| Temgesic (buprenorphine) | Essex Pharma | opioid analgesic | |
| Eye Ointment | Pan-Ophtal | 7136926 | |
| Xylazine | Bayer | ||
| EQUIPMENT | |||
| Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5 | Medical Developments Australia | ACN 004 903 682 | |
| Capillary puller P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Compresstome | Precisionary Instr. | VF-300 | Vibratome-type device |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cryostat | Leica | CM3050S | |
| Electroporator | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY21EDIT | |
| Electrode 1 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY550-10 | Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam. |
| Electrode 2 | Nepa Gene Co. Ltd. | CUY700P4L | Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter |
| Fiberoptic cold light source | Leica | KL2500 LCD | |
| Glass capillaries | Harvard Apparatus | GC120T-15 | 1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D. |
| Glass bead sterilizer | Fine Science Tools | FST250 | |
| Heating pad | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Injection device | World Precision Instruments | Pneumatic Pico Pump PV820 | |
| Suture Thread Coated Vicryl | Ethicon | V4914 | Peritoneal Suture |
| Suture Thr. Supramid | Serag Wiessner | TO07171L | Skin Suture |
Riferimenti
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