Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Summary

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Abstract

Om de gebeurtenissen een hartontwikkeling onderzoeken en de moleculaire mechanismen die leiden tot myocardiale ziektes bij mensen te bepalen, is het noodzakelijk eerst functionele humane hartspiercellen (CM) genereren. Het gebruik van deze cellen in drug discovery en toxicologische studies ook zeer gunstig, waardoor nieuwe farmacologische moleculen voor de behandeling van cardiale stoornissen preklinisch gevalideerd op cellen van menselijke oorsprong. Van de mogelijke bronnen van CM, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen behoren tot de meest veelbelovende, aangezien ze direct kunnen worden afgeleid uit gemakkelijk toegankelijk weefsel van de patiënt en bezit een intrinsieke vermogen om aanleiding te geven tot alle celtypes van het lichaam ^1. Er zijn verschillende methoden voorgesteld voor de differentiatie van iPS cellen in CM's, variërend van de klassieke embryoid instanties (EBS) aggregatie aanpak van chemisch gedefinieerde protocollen ^2,3. In dit artikel wordt een EBS-gebaseerd protocol stellen we en laten zien hoe deze methodiekd kan worden gebruikt om efficiënt genereren functionele CM-achtige cellen uit voedingsvrije iPS cellen.

Introduction

Historisch gezien, heeft het onderzoek naar de genetische en moleculaire mechanismen achter de menselijke ontwikkeling en de ziekte is gebaseerd op het genereren van genetisch gemodificeerde diermodellen. Echter, een groot aantal menselijke fenotypes niet succesvol gerepliceerd in muizen, vooral als gevolg van de biologische verschillen tussen de twee soorten. Anderzijds, toegang tot menselijke weefsels kan worden beperkt en vaak geen voldoende materiaal te verkrijgen voor diepgaande experimentele studies. Het gebied van de cardiovasculaire biologie lijdt aan beide beperkingen: de fysiologie van het menselijk hart significant verschilt van die van de muis, en een aanzienlijke hoeveelheid van hartweefsel is alleen post mortem of tijdens hartchirurgie. Vinden van een optimale bron voor de differentiatie van functionele humane CM's heeft dan ook een centraal thema in de cardiovasculaire biologie geworden, en veel moeite is gedaan om dit probleem aan te pakken. Diverse soorten cellen zijn voorgesteld, including skeletmyoblasten, lokale hartstamcellen, beenmerg mononucleaire cellen endotheliale stamcellen en mesenchymale stamcellen. Echter, gegevens verkregen met behulp van deze cellen niet consistent ⁴ geweest.

De winning van menselijke embryonale stamcellen (ESC) eerste ⁵ en de baanbrekende ontdekking van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen door Yamanaka en Thomson ^6,7 leek later oplossingen: deze cellen hebben het vermogen om onbeperkt groeien en het potentieel te bieden stijgen alle mobiele derivaten van de drie kiemlagen, zoals de CMS. Het gebruik van iPS cellen heeft verdere voordelen: afgeleid is van autologe volwassen cellen, zij dragen het genoom van de persoon of patiënt waarvan ze zijn afgeleid. Ze laten dan ook de ontwikkeling van in vitro modellen die het onderzoek van menselijke genetische ziekten en mechanismen van de ontwikkeling te bevorderen. Op grond van dit karakteristieke, kan iPS cellen ook overcome problemen met betrekking tot afstoting en ethische kwesties ^8. Daarom, hoewel SER nog altijd de gouden standaard op het gebied biologie van stamcellen, onderzoekers wereldwijd nu verplaatsen naar iPS celtechnologie.

iPS cellen worden nu gebruikt om menselijke ziekten te modelleren in vitro voor verschillende aandoeningen, waaronder aangeboren cardiovasculaire aandoeningen ^9,10. Onlangs, heeft de toepassing van de iPS-cel ziekte modellering uitgevoerd voor monogene cardiale aandoeningen (dwz lange QT-syndroom, catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie) en pathologieën waarin hartafwijkingen zijn onderdeel van een complex fenotype (dwz Leopard en Timothy syndromen, gedilateerde cardiomyopathie). Deze rapporten bevestigden dat patiënt-specifieke iPS cellen die worden onderscheiden in CM's weer te geven soortgelijke fenotypische en functionele kenmerken als de ziekte in vivo.

Ernog vele uitdagingen voor de werkzaamheid van het induceren van de iPS cellen in het hart lijn verbeteren. Spontane generatie van CM's uit menselijke SER via aggregaatvorming genaamd embryoid instanties (EBS) hebben bewezen succesvol ^17. Sinds deze ontdekking, hebben vele werkwijzen voorgesteld. Veel groepen hebben sterk verbeterde de efficiëntie van de differentiatie protocol en zijn verhuisd naar chemisch gedefinieerde en dierlijk bijproduct-vrije cultuur reagentia (zie Mummery, C., et al.., Circulation Research (2012) voor een uitgebreid overzicht van alle bestaande methoden ³ ).

Toch is de klassieke methode op basis van EB aggregatie vertegenwoordigt nog steeds de meest gebruikte voor het uitvoeren van functionele studies en onderzoeken ziektemechanismen. De voorgestelde protocol is gebaseerd op de aggregatie van iPS cellen in EBS en cultuur in de aanwezigheid van serum en ascorbinezuur, dat is aangetoond dat het cardiaal differentiatieproces verbeteren en positively invloed hebben op de rijping van deze cellen ^18,19. In dit artikel gaan we door middel van deze methode in detail en zal laten zien hoe je feeder-vrije iPS cellijnen gebruiken voor het genereren van patiënt-specifieke iPS-afgeleide CM's.

Protocol

1. Feeder-free Onderhoud en passage van de Mens iPS Cell Lines Bereid de Matrigel-gecoate gerechten. Dooi een flacon van menselijke ESC-gekwalificeerde Matrix op ijs gedurende een uur en verdun het in 25 ml DMEM-F12 medium. Voeg 1 ml voor elke 35 mm plaat (of equivalente hoeveelheden per oppervlakte als andere gerechten worden gebruikt), om alles op ijs en ervoor te zorgen dat alle platen en buizen zijn voorgekoeld. Afdekplaten met aluminiumfolie. Opmerking:…

Representative Results

In onze studies gegenereerd we CM's uit verschillende iPS cellijnen. Deze lijnen werden aanvankelijk geproduceerd op een MEF feeder-laag, maar werden onmiddellijk geplaatst op Matrigel het gebruik van een bepaald medium (ofwel mTESR1 of Nutristem). Verschillende assays werden gebruikt voor het onderhoud van de morfologische eigenschappen, de expressie van markers kenmerkend pluripotente cellen (OCT-4, SSEA4 en TRA1-60) en de stabiliteit van het genoom (figuur 1) te controleren. <p class="jove_co…

Discussion

Pluripotente stamcellen hebben het potentieel om spontaan differentiëren in CM, zij het met lage efficiëntie en hoge variabiliteit tussen lijnen. De ontwikkeling van nieuwe methoden inductie is daarom gericht op de verbetering van de werkwijze en bewegen naar meer gedefinieerde protocollen. De meeste van deze nieuwe differentiatie methoden zijn zeer complex en vereist uitgebreide kweekomstandigheden, fijne controle van timing en concentratie van reagentia, en behandeling met dure cytokines en groeifactoren. Ook versch…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon