Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.
Om de gebeurtenissen een hartontwikkeling onderzoeken en de moleculaire mechanismen die leiden tot myocardiale ziektes bij mensen te bepalen, is het noodzakelijk eerst functionele humane hartspiercellen (CM) genereren. Het gebruik van deze cellen in drug discovery en toxicologische studies ook zeer gunstig, waardoor nieuwe farmacologische moleculen voor de behandeling van cardiale stoornissen preklinisch gevalideerd op cellen van menselijke oorsprong. Van de mogelijke bronnen van CM, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen behoren tot de meest veelbelovende, aangezien ze direct kunnen worden afgeleid uit gemakkelijk toegankelijk weefsel van de patiënt en bezit een intrinsieke vermogen om aanleiding te geven tot alle celtypes van het lichaam 1. Er zijn verschillende methoden voorgesteld voor de differentiatie van iPS cellen in CM's, variërend van de klassieke embryoid instanties (EBS) aggregatie aanpak van chemisch gedefinieerde protocollen 2,3. In dit artikel wordt een EBS-gebaseerd protocol stellen we en laten zien hoe deze methodiekd kan worden gebruikt om efficiënt genereren functionele CM-achtige cellen uit voedingsvrije iPS cellen.
Historisch gezien, heeft het onderzoek naar de genetische en moleculaire mechanismen achter de menselijke ontwikkeling en de ziekte is gebaseerd op het genereren van genetisch gemodificeerde diermodellen. Echter, een groot aantal menselijke fenotypes niet succesvol gerepliceerd in muizen, vooral als gevolg van de biologische verschillen tussen de twee soorten. Anderzijds, toegang tot menselijke weefsels kan worden beperkt en vaak geen voldoende materiaal te verkrijgen voor diepgaande experimentele studies. Het gebied van de cardiovasculaire biologie lijdt aan beide beperkingen: de fysiologie van het menselijk hart significant verschilt van die van de muis, en een aanzienlijke hoeveelheid van hartweefsel is alleen post mortem of tijdens hartchirurgie. Vinden van een optimale bron voor de differentiatie van functionele humane CM's heeft dan ook een centraal thema in de cardiovasculaire biologie geworden, en veel moeite is gedaan om dit probleem aan te pakken. Diverse soorten cellen zijn voorgesteld, including skeletmyoblasten, lokale hartstamcellen, beenmerg mononucleaire cellen endotheliale stamcellen en mesenchymale stamcellen. Echter, gegevens verkregen met behulp van deze cellen niet consistent 4 geweest.
De winning van menselijke embryonale stamcellen (ESC) eerste 5 en de baanbrekende ontdekking van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen door Yamanaka en Thomson 6,7 leek later oplossingen: deze cellen hebben het vermogen om onbeperkt groeien en het potentieel te bieden stijgen alle mobiele derivaten van de drie kiemlagen, zoals de CMS. Het gebruik van iPS cellen heeft verdere voordelen: afgeleid is van autologe volwassen cellen, zij dragen het genoom van de persoon of patiënt waarvan ze zijn afgeleid. Ze laten dan ook de ontwikkeling van in vitro modellen die het onderzoek van menselijke genetische ziekten en mechanismen van de ontwikkeling te bevorderen. Op grond van dit karakteristieke, kan iPS cellen ook overcome problemen met betrekking tot afstoting en ethische kwesties 8. Daarom, hoewel SER nog altijd de gouden standaard op het gebied biologie van stamcellen, onderzoekers wereldwijd nu verplaatsen naar iPS celtechnologie.
iPS cellen worden nu gebruikt om menselijke ziekten te modelleren in vitro voor verschillende aandoeningen, waaronder aangeboren cardiovasculaire aandoeningen 9,10. Onlangs, heeft de toepassing van de iPS-cel ziekte modellering uitgevoerd voor monogene cardiale aandoeningen (dwz lange QT-syndroom, catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie) en pathologieën waarin hartafwijkingen zijn onderdeel van een complex fenotype (dwz Leopard en Timothy syndromen, gedilateerde cardiomyopathie). Deze rapporten bevestigden dat patiënt-specifieke iPS cellen die worden onderscheiden in CM's weer te geven soortgelijke fenotypische en functionele kenmerken als de ziekte in vivo.
Ernog vele uitdagingen voor de werkzaamheid van het induceren van de iPS cellen in het hart lijn verbeteren. Spontane generatie van CM's uit menselijke SER via aggregaatvorming genaamd embryoid instanties (EBS) hebben bewezen succesvol 17. Sinds deze ontdekking, hebben vele werkwijzen voorgesteld. Veel groepen hebben sterk verbeterde de efficiëntie van de differentiatie protocol en zijn verhuisd naar chemisch gedefinieerde en dierlijk bijproduct-vrije cultuur reagentia (zie Mummery, C., et al.., Circulation Research (2012) voor een uitgebreid overzicht van alle bestaande methoden 3 ).
Toch is de klassieke methode op basis van EB aggregatie vertegenwoordigt nog steeds de meest gebruikte voor het uitvoeren van functionele studies en onderzoeken ziektemechanismen. De voorgestelde protocol is gebaseerd op de aggregatie van iPS cellen in EBS en cultuur in de aanwezigheid van serum en ascorbinezuur, dat is aangetoond dat het cardiaal differentiatieproces verbeteren en positively invloed hebben op de rijping van deze cellen 18,19. In dit artikel gaan we door middel van deze methode in detail en zal laten zien hoe je feeder-vrije iPS cellijnen gebruiken voor het genereren van patiënt-specifieke iPS-afgeleide CM's.
Pluripotente stamcellen hebben het potentieel om spontaan differentiëren in CM, zij het met lage efficiëntie en hoge variabiliteit tussen lijnen. De ontwikkeling van nieuwe methoden inductie is daarom gericht op de verbetering van de werkwijze en bewegen naar meer gedefinieerde protocollen. De meeste van deze nieuwe differentiatie methoden zijn zeer complex en vereist uitgebreide kweekomstandigheden, fijne controle van timing en concentratie van reagentia, en behandeling met dure cytokines en groeifactoren. Ook versch…
The authors have nothing to disclose.
BS werd gesteund door de Universiteit van Milaan-Bicocca Summer Student Research Training Program; onderzoek werd gesteund door fondsen van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid en het Italiaanse Ministerie van Onderwijs, Universiteit en Researchcentrum en Fondazione Humanitas aan GC, we danken Michael VG Latronico voor het kritisch lezen van de manuscript.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Media and Reagents | |||
Human ESC-qualified Matrix | BD Biosciences | 354277 | Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C . |
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution | Sigma | F0896-2MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
Laminin | Sigma | L2020-1MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
PBS (no Mg and Ca), 10X | Lonza | BE17-515F | |
PBS (with Mg and Ca), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
Dispase II, neutral protease, grade II | Roche | 4942078001 | Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca) |
Trypsin/EDTA, 0.5% | Sigma | T3924 | |
Collagenase type 2 | Worthington | 4176 | Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca |
DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C |
Foetal Bovine Serum (origin South America) | Invitrogen | 10270-106 | Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C |
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
N2 supplement, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
B27 supplement, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
2-mercaptoethanol | Invitrogen | 31350-010 | |
Gelatin, from porcine skin | Sigma | G1890-100G | Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C |
mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week |
Nutristem hESC XF | Stemgent from Biological Industries | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week. |
mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X) |
Plasticware | |||
35 mm culture dishes | Becton Dickinson | 353001 | |
Cell scraper | Corning Incorporated | 3008 | |
12-well plates | Becton Dickinson | 353043 | |
Permanox 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
Glass 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
6-well plates, ultra-low-attachment surface | Corning Incorporated | 3471 | |
18G needle | Becton Dickinson | 304622 | |
Glass pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
2.5 ml syringe | Becton Dickinson | 300188 | |
Equipments | |||
IVF Workstation | KSystem, by Nikon | ||
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon |