Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Summary

Pluripotenten Stammzellen, entweder embryonale oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), eine wertvolle Quelle der menschlichen differenzierten Zellen, einschließlich Herzmuskelzellen. Hier werden wir auf die kardiale Induktion der iPS-Zellen zu konzentrieren, die zeigen, wie man sie benutzt, um funktionelle menschliche Herzmuskelzellen durch eine Embryoidkörpern-basiertes Protokoll zu erhalten.

Abstract

Um die Ereignisse Antreiben Entwicklung des Herzens zu untersuchen und um die molekularen Mechanismen, die zu myokardialen Erkrankungen beim Menschen zu bestimmen, ist es wichtig, erste funktionalen humanen Kardiomyozyten (CMS) zu erzeugen. Die Verwendung dieser Zellen in der Wirkstoffforschung und toxikologischen Studien wäre auch sehr vorteilhaft, so dass neue pharmakologische Moleküle zur Behandlung von Herzerkrankungen vor, klinisch Zellen menschlichen Ursprungs validiert werden. Von den möglichen Quellen der CMs sind induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zu den vielversprechendsten, da sie direkt aus leicht zugänglichen Patientengewebe abgeleitet werden und besitzen eine intrinsische Fähigkeit, die zu allen Zelltypen des Körpers ¹ zu geben. Mehrere Methoden zur Differenzierung iPS-Zellen in CMs vorgeschlagen worden, angefangen von der klassischen Embryoidkörpern (EVG) Aggregation Ansatz zur chemisch definierten Protokollen ^2,3. In diesem Artikel werden wir vorschlagen, ein EBS-basiertes Protokoll und zeigen, wie diese method eingesetzt werden, um effizient zu erzeugen funktionale CM-Zellen aus Feeder-freie iPS-Zellen werden.

Introduction

Historisch gesehen hat die Untersuchung der genetischen und molekularen Mechanismen, die menschliche Entwicklung und die Krankheit auf die Erzeugung von gentechnisch veränderten Tiermodellen basiert. Allerdings scheitern zahlreichen menschlichen Phänotypen bei Mäusen erfolgreich repliziert werden, vor allem wegen der biologischen Unterschiede zwischen den beiden Arten. Auf der anderen Seite, zu menschlichen Geweben zugreifen kann begrenzt werden und oft nicht genügend Material für eingehende experimentelle Untersuchungen erhalten werden. Das Gebiet der Herz-Kreislauf-Biologie leidet unter diesen beiden Einschränkungen: die Physiologie des menschlichen Herzens ist signifikant verschieden von der Maus, und eine beträchtliche Menge von Herzgewebe ist nur post-mortem oder während einer Herzoperation. Das Finden einer optimalen Quelle für die Differenzierung von funktionellen humanen CMS hat deshalb zu einem zentralen Thema in der Herz-Kreislauf-Biologie und viel Anstrengung wurde unternommen, um dieses Problem zu beheben. Verschiedene Zelltypen wurden vorgeschlagen, including Skelettmyoblasten, lokalen kardialen Stammzellen, Knochenmark mononukleären Zellen, Endothelzellen Vorläuferzellen und mesenchymalen Stammzellen. Allerdings erhaltenen Daten unter Verwendung dieser Zellen noch nicht durchgängig ^4.

Die Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen (ESC) und die ersten ⁵ bahnbrechende Entdeckung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Yamanaka und Thomson ^6,7 später schien Lösungen: Diese Zellen haben die Fähigkeit, unbegrenzt zu wachsen und das Potenzial zu geben steigen, um alle Zellen Derivate der drei Keimblätter, einschließlich der CMs. Die Verwendung von IPS-Zellen bietet weitere Vorteile: ist aus autologen adulten Zellen abgeleitet, tragen sie die gleichen Genom des Individuums oder Patienten, aus denen sie abgeleitet sind. Sie ermöglichen damit die Entwicklung von in-vitro-Modelle, die die Untersuchung von menschlichen genetischen Erkrankungen und Mechanismen der Entwicklung zu erleichtern. Auf Grund dieser Eigenschaft können iPS-Zellen auch overcome Probleme im Zusammenhang mit Immunabwehr und ethische Fragen ^8. Aus diesen Gründen, obwohl WSR noch den Goldstandard im Bereich der Stammzellbiologie darstellen, sind Forscher weltweit nun mehr bewegen zu iPS-Technologie.

iPS-Zellen werden nun verwendet werden, um menschliche Krankheiten in vitro-Modell für verschiedene Bedingungen, einschließlich angeborenen Herz-Kreislaufstörungen ^9,10. Vor kurzem hat Anwendung von iPS-Zellen Krankheit Modellierung für monogenic Herzerkrankungen (dh Long-QT-Syndrome, katecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachykardie) und Pathologien, bei denen Herzfehler sind Teil eines komplexen Phänotyp (dh Leopard und Timothy-Syndrom, dilatative Kardiomyopathie) durchgeführt. Diese Berichte bestätigt, dass Patienten-spezifischen iPS-Zellen, die in CMs differenziert werden ähnliche phänotypische und funktionelle Eigenschaften aufweisen, wie die Krankheit in vivo.

Allerdings gibtsind noch viele Herausforderungen, um die Wirksamkeit zu induzieren die iPS-Zellen in das Herz-Linie zu verbessern. Spontane Generation von CMS aus menschlichen WSR über Aggregatbildung genannt Embryoidkörpern (EVG) haben erfolgreich ¹⁷ bewährt. Seit dieser Entdeckung wurden viele andere Methoden vorgeschlagen worden. Viele Gruppen haben sich die Effizienz der Differenzierung Protokoll weiterentwickelt und haben zu chemisch definierten und Tier-product-freie Kultur Reagenzien bewegt (siehe Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) für eine umfassende Überprüfung aller bestehenden Methoden ³ ).

Dennoch ist die klassische Methode auf EB Aggregation basiert immer noch das am häufigsten für die Durchführung funktionelle Studien und Erforschung von Krankheiten Mechanismen eingesetzt. Unsere vorgeschlagene Protokoll basiert auf der Aggregation von iPS-Zellen in EBs und Kultur in Gegenwart von Serum und Ascorbinsäure, die gezeigt wurde, dass die kardiale Differenzierung Prozess zu verbessern und po Basissitively Auswirkungen auf die Reifung dieser Zellen ^18,19. In diesem Artikel werden wir durch diese Methodik im Detail zu gehen und zeigen, wie Feeder-freie iPS-Zelllinien zur Erzeugung von Patienten-spezifischen iPS-abgeleiteten CMs verwenden.

Protocol

1. Feeder-freie Wartung und Passagieren der menschlichen iPS-Zelllinien Bereiten Sie die Matrigel-beschichteten Schalen. Tauwetter ein Fläschchen des menschlichen ESC qualifizierte Matrix auf Eis für eine Stunde und verdünnen Sie es in 25 ml DMEM-F12 Medium. 1 ml bis 35 mm je Platte (oder äquivalente Mengen pro Fläche, wenn andere Gerichte verwendet werden), halten alles auf Eis und sicherzustellen, dass alle Platten und Rohre vorgekühlt sind. Die Platten mit Aluminiumfolie. <p class="jove_con…

Representative Results

In unseren Studien haben wir erzeugt CMs aus mehreren iPS-Zelllinien. Diese Linien wurden zunächst auf einem MEF Feeder-Schicht erzeugt, sondern wurden sofort auf Matrigel platziert mit einem definierten Medium (entweder mTESR1 oder Nutristem). Verschiedene Tests wurden verwendet, um die Wartung der morphologischen Eigenschaften, die Expression von Markern typisch für pluripotente Zellen (OCT-4, SSEA4 und TRA1-60) und ihre Stabilität des Genoms (Abbildung 1) zu überprüfen. <p class="jove_conten…

Discussion

Pluripotenten Stammzellen haben das Potenzial, spontan differenzieren sich in CMs, wenn auch mit geringer Effizienz und hohe Variabilität zwischen Linien. Die Entwicklung neuer Induktion Methoden wurde deshalb zur Verbesserung der Effizienz des Verfahrens und der sich in Richtung mehr definierten Protokollen konzentriert. Allerdings sind die meisten dieser neuen Differenzierungsmethoden ziemlich komplex und erfordert aufwendige Kulturbedingungen Feinsteuerung der Zeitpunkt und die Konzentration der Reagenzien, und die …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon