İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü
Summary
Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.
Abstract
Kalp gelişimine sürüş olaylarının araştırılması için ve insanlarda miyokard hastalıklara yol açan moleküler mekanizmaların belirlenmesi amacıyla, fonksiyonel insan kardiyomiyositlerde (CMS) oluşturmak için birinci şarttır. Ilaç keşfi ve toksikoloji çalışmaları, bu hücrelerin kullanımı da insan kaynaklı hücreler üzerinde ön-klinik olarak geçerli olmak üzere kardiyak bozuklukların tedavisinde yeni moleküller sağlayan, yüksek ölçüde yararlı olacaktır. CMs olası kaynaklarının, uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri kolayca erişilebilir hasta doku doğrudan elde edilebilir gibi, en umut verici arasındadır ve vücudun 1 her hücre tipleri neden bir içsel kapasiteye sahip. Çeşitli yöntemler kimyasal olarak tanımlanmış protokoller 2,3 için klasik embriyoid organları (EBS) toplama yaklaşımı arasında değişen, CMs içine iPS hücreleri ayırt etmek için önerilmiştir. Bu yazıda bir EBS-tabanlı protokol teklif ve göstermek nasıl bu metodolojid verimli besleyici ücretsiz iPS hücrelerinden işlevsel CM-benzeri hücreler üretmek için kullanılabilir.
Introduction
Tarihsel olarak, insan gelişimi ve hastalık sürüş genetik ve moleküler mekanizmalar soruşturma genetiği değiştirilmiş hayvan modellerinin nesil dayanmaktadır. Ancak, çok sayıda insan fenotipleri başarıyla başlıca nedeni iki tür arasında var olan biyolojik farklılıkların, farelerde çoğaltılması için başarısız. Diğer taraftan, insan doku erişim sınırlı olabilir ve genellikle yeterli malzeme derinlemesine Deneysel çalışmalarda elde edilmesine izin yoktur. Kardiyovasküler biyoloji alanında bu sınırlamalar her iki muzdarip: insan kalbinin fizyolojisi fare bu önemli ölçüde farklı olduğu ve kalp dokusu önemli bir miktar sadece ölüm sonrası ya da kalp ameliyatı sırasında erişilebilir. Fonksiyonel insan CMs farklılaşması için en uygun kaynak bulmak bu nedenle kardiyovasküler biyoloji merkezi bir konu haline gelmiştir, ve çok çaba bu sorunu gidermek için yapılmıştır. Çeşitli hücre tipleri i, önerilmiştirncluding iskelet iskelet hücreleri yanında, yerel kardiyak kök hücreler, kemik iliği mononükleer hücreler, endotelyal ataları ve mezenkimal kök hücreler. Ancak, veri 4 tutarlı olmamıştır, bu hücreler kullanılarak elde edilmiştir.
Insan embriyonik kök hücreleri (ESC) türetilmesi ilk 5 ve Yamanaka ve Thomson 6,7 ile uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerin çığır açan keşfi daha sonra çözümler sunmak gibiydi: bu hücrelerin vermek için süresiz büyümeye yeteneği ve potansiyeline sahip CMs dahil olmak üzere üç germ her hücresi türevleri, yükselecek. IPS hücrelerinin kullanılması daha başka avantajları sunmaktadır: otolog yetişkin hücrelerinden türetilen, bunlar türetildiği tek tek ya da hasta ile aynı gen taşır. Bu nedenle, insan genetik hastalıklar ve gelişme mekanizmalarının incelenmesi kolaylaştırmak in vitro modeller gelişimini sağlar. Bu özelliği sayesinde ise, iPS hücreleri de o olabilirbağışıklık ret ve etik konular 8 ile ilgili vercome sorunları. EKH hala kök hücre biyolojisi alanında altın standart temsil etse de bu nedenlerden dolayı, araştırmacılar dünya çapında şu anda iPS hücresi teknolojisi karşı daha hareket ediyor.
iPS hücreleri, hemen konjenital kardiyovasküler bozukluklar da dahil olmak üzere, çeşitli koşullar 9,10 için, in vitro olarak insan hastalığı olan model için kullanılmaktadırlar. Son zamanlarda, iPS hücre hastalığı modelleme uygulaması monogenik kalp hastalıkları (örneğin uzun QT sendromları, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi) ve kalp kusurları karmaşık bir fenotip (yani Leopard ve Timothy sendromlar, dilate kardiyomiyopati) bir parçası olduğu patolojiler için yapılmıştır. Bu raporlar CMs ayrılırlar hastaya özgü iPS hücreleri in vivo hastalık olarak benzer fenotipik ve fonksiyonel özellikler gösterdiği doğruladı.
Ancak,kalp soy içine iPS hücreleri tetikleme etkinliğini artırmak için hala pek çok sorun vardır. Agrega oluşumu yoluyla insan EKH gelen CMs spontan nesil embriyoid organları (EBS) başarılı 17 kanıtlanmıştır çağırdı. Bu keşfinden beri, pek çok yöntem önerilmiştir. Birçok grup büyük ölçüde farklılaşma protokol verimliliği gelişmiş ve (Mummery bakınız, C., ve diğerleri., Mevcut tüm yöntemleri 3 kapsamlı bir inceleme için sirkülasyon Araştırma (2012) kimyasal olarak tanımlanmış ve hayvan-ürün içermeyen kültür reaktifler doğru taşındı .)
Bununla birlikte, EB toplama dayalı klasik yöntem hala en sık fonksiyonel çalışmalar yapmak ve hastalık mekanizmaları araştırmak için istihdam temsil eder. Bizim önerilen protokol kalp farklılaşma sürecini geliştirmek için gösterilmiştir, serum ve askorbik asit varlığında EBS içine iPS hücreleri, agregasyon ve kültür ve po alınmaktadır18,19 regüle edilebilen bu hücrelerin olgunlaşmasını etkileyebilir. Bu yazıda ayrıntılı olarak bu metodoloji üzerinden gidecek ve hastaya özgü iPS-türetilmiş CMs üretmek için besleyici-ücretsiz iPS hücre hatları nasıl kullanılacağını gösterecektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pluripotent kök hücreler hatları arasında düşük verimlilik ve yüksek değişkenliği ile de olsa, CMs kendiliğinden ayırt potansiyeline sahiptir. Yeni indüksiyon yöntemlerinin geliştirilmesi bu nedenle sürecinin verimliliğini artırmak ve daha tanımlı protokoller doğru hareket odaklanmıştır. Bununla birlikte, bu yeni farklılaşma yöntemlerin en ayrıntılı kültür koşulları, zamanlama ve reaktif konsantrasyonu iyi kontrol ve pahalı sitokinler ve büyüme faktörleri ile tedavi gerektiren, old…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
BS Milan-Bicocca Yaz Öğrenci Araştırma Eğitim Programı Üniversitesi tarafından desteklenmiştir, araştırma Sağlık ve İtalyan Bakanlığı Eğitim, Üniversite ve GC için Araştırma ve Fondazione Humanitas, İtalyan Bakanlığı fonlarından desteklenen, biz eleştirel okumak için Michael VG Latronico teşekkür el yazması.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Media and Reagents | |||
| Human ESC-qualified Matrix | BD Biosciences | 354277 | Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C . |
| Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution | Sigma | F0896-2MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| Laminin | Sigma | L2020-1MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
| PBS (no Mg and Ca), 10X | Lonza | BE17-515F | |
| PBS (with Mg and Ca), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
| Dispase II, neutral protease, grade II | Roche | 4942078001 | Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca) |
| Trypsin/EDTA, 0.5% | Sigma | T3924 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | 4176 | Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C |
| Foetal Bovine Serum (origin South America) | Invitrogen | 10270-106 | Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C |
| PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
| GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
| MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
| N2 supplement, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
| 2-mercaptoethanol | Invitrogen | 31350-010 | |
| Gelatin, from porcine skin | Sigma | G1890-100G | Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week |
| Nutristem hESC XF | Stemgent from Biological Industries | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week. |
| mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X) |
| Plasticware | |||
| 35 mm culture dishes | Becton Dickinson | 353001 | |
| Cell scraper | Corning Incorporated | 3008 | |
| 12-well plates | Becton Dickinson | 353043 | |
| Permanox 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
| Glass 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
| 6-well plates, ultra-low-attachment surface | Corning Incorporated | 3471 | |
| 18G needle | Becton Dickinson | 304622 | |
| Glass pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| 2.5 ml syringe | Becton Dickinson | 300188 | |
| Equipments | |||
| IVF Workstation | KSystem, by Nikon | ||
| Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon |
Riferimenti
- Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function. Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).
- Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
- Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132, 537-543 (2008).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Yamanaka, S. A fresh look at iPS cells. Cell. 137, 13-17 (2009).
- Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders. Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2012).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).
- Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471, 230-234 (2011).
- Itzhaki, I., et al. Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells. Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).
- Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).
- Cao, N., et al. Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells. Cell Research. 22, 219-236 (2012).
- Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107, 1912-1916 (2003).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
