의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em> 사카 cerevisiae의</em
Summary
이 문서에서는 조사 반딧불 루시 페라 제 – GFP 융합 단백질의 사용을 설명합니다<em> 생체 내</em>의 단백질 폴딩<em> 사카 cerevisiae의</em>. 모델 열 변성 된 단백질의 접힘이 시약을 사용하면 형광 현미경 및 단백질 품질 관리 proteostasis 네트워크 구성 요소의 역할을 조사하는 효소 분석에 의해 동시에 모니터링 할 수 있습니다.
Abstract
단백질 폴딩 / 생합성의 통합 프로세스로 정의 Proteostasis는 재 접힘 / 수리, 그리고 성능 저하, 해로운 결과 1을 방지하기 위해 유지해야하는 섬세한 세포의 균형이다. 이 균형을 방해 외부 또는 내부 요인 단백질 응집, 독성 및 세포 죽음으로 이어질 수 있습니다. 인간이는 헌팅턴의, 파킨슨, 알츠하이머 병 10 신경 퇴행성 질환과 관련된 증상에 대한 주요 기여 요소이다. 그것은 proteostasis의 유지 보수에 관련된 단백질이 쇠약 질병에 대한 치료법을 개발하기 위해 확인하는 것이 필수적이다. 이 문서에서는 녹색 형광 단백질 (FFL-GFP)을 융합 한 모델 단백질 반딧불 루시 페라 제를 사용하여 실시간에 가까운 해상도로 생체 내 단백질 폴딩의 모니터링을위한 기술을 설명합니다. FFL 부분은 스트레스 유발 m에 매우 민감로 FFL-GFP는 고유 모델 키메라 단백질효소 12 불 활성화 isfolding 및 집계. 루시 페라 제 활동은 효소 분석을 사용하여 모니터링하고, GFP 부분은 자동화 된 현미경을 사용하여 수용성 또는 집계 FFL을 시각화하는 방법을 제공합니다. 이러한 결합 방법은 재 접힘과 스트레스 후 효소의 기능을 재 활성화 모두를 분석하기 위해 두 개의 병렬 기술적으로 독립적 인 접근 방식을 통합합니다. 활동 복구는 직접 더 나은 이러한 단백질 보호자와 같은 단백질 품질 관리 요소가 이러한 기능을 수행하기 위해 협력하는 방법을 이해하기 위해 세분화하고 다시 가용화 반응 속도와 상관 될 수 있습니다. 또한, 유전자 삭제 또는 돌연변이는이 과정에 특정 단백질 또는 단백질 소단위의 기여를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 문서에서 우리는이 방법의 유효성을 검사하는 단백질 재 접힘에 시스템 5 접힘 Hsp40/70/nucleotide 교환 계수 (NEF) 파트너로 알려진 단백질 disaggregase Hsp104 13 일의 기여를 검사합니다.
Introduction
인간의 알츠하이머, 파킨슨 병, 헌팅턴의 질환 등 퇴행성 신경 질환은 단백질의 misfolding 및 집계 10에 연결되어있다. 세포는 잘못 접힌 비활성 구조 6으로 세포 단백질의 운동 포획을 방지하기 위해 분자 보호자를 사용합니다. 보호자는 세포 내의 복잡한 상호 작용 네트워크에 참여하지만, 그것은 완전히 이러한 상호 작용의 합이 생명체의 proteostasis에 기여하는 방법을 이해하지 않습니다. 세포질 단백질 폴딩의 대부분을 담당하는 주 보호자의 하나는 70 kD의 열 충격 단백질 (Hsp70의) 가족 19이다. 이 표시되었음을 Hsp70의 감소 효모 손실 초기 발현 된 FFL을 접을 생체 18, 7 내인성 단백질, 오르니 틴 transcarbamoylase를 재 접힘 할 수있다. 실시간에 가까운 해상도로 접는 분석 할 수있는 능력은 이해를 촉진하는 방법을 추가로 휴대 요인 연속이 Hsp70의 종속 프로세스에 ribute. 또한, 폴딩 / 반응 접힘은이 기여하는 단백질에 완전히 의존하지 않을 수 있으므로 분석은 반응 속도와 효율성에 크고 작은 변화를 모두 감지 할 정도로 민감해야합니다.
효모 세포 disaggregase, Hsp104는 집계 잘못 접힌 단백질을 수리에서 중요한 역할을합니다. Hsp104 상동는 곰팡이와 식물에서 발견되었지만,이 가족은 후생에없는 것 같습니다. 이 같은 Hsp110 가족들과 같은 다른 보호자는 포유류 16 알려진 Hsp104 활동의 일부를 수행 할 것을 제안하고있다. Hsp104는 AAA +, hexameric 단백질 복합체입니다 리모델링 단백질 집계에 효모의 기능, 재 접힘 및 수리 13에 기여. Hsp70의 효모, Ssa1, 그리고 효모 Hsp40, Ydj1와 함께 Hsp104는, 효모 세포 5, 8 변성 FFL을 복구해야합니다. 작은 열 충격 단백질, Hsp26은 또한 requi 것으로 표시되었습니다FFL 2 Hsp104 매개 세분화 빨간색.
FFL은 기판의 활성 부위에있는 루시페린과 ATP, 산소, decarboxylates을 필요로하는 구조적 변화에 따라 바인딩 두 개의 도메인 단백질 oxyluciferin, 이산화탄소 (CO 2), 아데노신 일 인산염 (AMP), 가벼운 11를 풀어 기판 9, 3. 상업적으로 이용 가능한 FFL 기판, D-루시페린, luminometer 15를 사용하여 검색 할 수 있습니다 550-570 nm의 사이에 발광 결과. FFL은 전개시 화학 물질 또는 열처리 빠르게 집계에서 변성을 정교하게 구분합니다. 39-45 사이의 온도에 노출되었을 때 ° C FFL은 가역적으로 전개 및 비활성화 12입니다. 반면, GFP 및 그 유도체는 스트레스 14 전개 단백질이 뛰어납니다. 따라서이 두 단백질의 융합 기능 G를 타겟팅 할 수있는 실험적으로 불안정한 부분의 기능을 FFL 수 있습니다FP는 인구와 단일 세포 수준 모두에서 형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 예금을 세포 내. 자동화 된 현미경과 결합 반자동 멀티 플레이트 리더 효소 분석의 응용 프로그램 속도론 및 반응 접힘 수율의 전례없는 동시 평가를 할 수 있습니다. 또한, 모델 진핵 생물 인 Saccharomyces cerevisiae의의 손쉬운 분자 유전학 정확한 단백질 품질 관리 네트워크의 조작과 세포 스트레스 반응 및 proteostasis에 기여하는 새로운 플레이어를 식별하는 검색 기반의 접근 기회를 모두 할 수 있습니다.
본 연구에서는 FFL-GFP를 표현 야생형 (WT)와 HSP104 삭제 변종 단백질 변성 열 충격을받습니다. FFL-GFP의 재 접힘은 복구 시간 과정을 통해 표현 프로테옴의 수리를 위해 프록시 판독 등의 효소 분석 및 현미경 모두를 통해 모니터링됩니다. WT 세포에 비교하면, 우리는 일을 보여전자 Hsp104 삭제 균주는 변성 FFL 2의 재 활성화에 Hsp104의 역할을 확립 이전의 연구를 지원, FFL-GFP를 접힘시 ~ 60 % 덜 효율적이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는 모델 단백질은 FFL-GFP는 효모 disaggregase이 Hsp104 단백질 재 가용화 및 수리에 기여하는 것을 보여주기 위해 사용되었다. 효소 분석과 현미경 차동 접힘 효율과 수율을 결정하기 위해 동일한 기판 단백질의 상태를 심문. 효소 복구 분석의 결과는 비효율적 hsp104D 균주의 최대 복구 만이 아니다하는 것이 좋습니다,하지만 전개 스트레스의 초기 크기는 돌연변이 균주 (그림 2)?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 KAM 우리는 또한 FFL을 제공하는 토론토 대학의 존 글로버 감사 JLA에 미생물 로버트 D. 왓킨스 대학원 학생 연구 친교의 미국 사회에 건강의 국립 연구소 (NIGMS-074696)에서 부여에 의해 지원되었다 -GFP 소스 플라스미드.
Materials
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 |
Riferimenti
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