ETT<em> Caenorhabditis elegans</em> Modellsystem för Amylopathy Study

Summary

Vi beskriver metoder för att studera aspekter av amylopathies i masken<em> C. elegans</em>. Vi visar hur man konstruerar maskar uttrycker humant Ap₄₂ I nervceller och hur man testar deras funktion i beteendemässiga analyser. Vi visar vidare hur man erhålla primära neuronala kulturer som kan användas för farmakologisk testning.

Abstract

Amylopathy är en term som beskriver onormal syntes och ackumulation av amyloid beta (beta) i vävnader med tiden. Ap är ett kännetecken för Alzheimers sjukdom (AD) och finns i Lewy body demens, inklusionskroppsmyosit och cerebral amyloid angiopati ^1-4. Amylopathies utvecklas gradvis med tiden. Av denna anledning enkla organismer med korta livslängder kan bidra till att belysa molekylära aspekter av dessa villkor. Här beskriver vi experimentella protokoll för att studera Ap-medierad neurodegeneration använder Caenorhabditis elegans. Därför konstruerar vi transgena maskarna genom att injicera DNA som kodar för humant Ap ₄₂ in i syncytiala könskörtlarna av vuxna hermafroditer. Transformantlinjer stabiliseras genom en mutagenes-inducerad integration. Har åldern synkroniseras genom att samla och sådd sina ägg Nematoder. Funktionen av nervceller som uttrycker Ap ₄₂ testas i opportuna beteendemässiga analyser (kemotaxianalyss). Primära neuronala kulturer erhållna från embryon utgör komplement beteendemässiga data och för att testa de nervskyddande effekterna av anti-apoptotiska föreningar.

Introduction

Amyloid beta (A-beta) är en peptid med 36-43 aminosyror som bildas efter sekventiell klyvning av amyloid prekursorprotein (APP) genom β och sekretaser γ ^1. Den γ secretase bearbetar C-terminala änden av Ap-peptid och ansvarar för dess olika längd ^5. De vanligaste formerna av Ap är AP ₄₀ och AP _42, den senare vanligen förknippas med patologiska tillstånd såsom AD ^5. Vid höga koncentrationer Ap bildar β-ark som samlas för att skapa amyloidfibriller ^6. Fibriller insättningar är den viktigaste komponenten i senila plack omgivande nervceller. Både plack och diffunderbara, icke-plack oligomerer Ap, tros vara underliggande patogena former av Ap.

Laboratory studie av neuronala amylopathies kompliceras av det faktum att dessa villkor framsteg med tiden. Därför är det important för att utveckla genetiskt foglig djurmodeller-komplementär till möss-med kort livslängd. Dessa modeller kan användas för att belysa specifika aspekter av amylopathies-typisk cell-och molekylär-och i kraft av sin enkelhet, hjälpa till att fånga essensen av problemet. Masken Caenorhabditis elegans falls är denna kategori. Den har en kort livslängd, ~ 20 dagar och dessutom grundläggande cellulära processer, inklusive reglering av genuttryck, protein trafficking, nervkopplingar, synaptogenes, cellsignalering, och döden liknar däggdjurs ^7. Unika egenskaper för masken inkluderar kraftfulla genetik och brist på ett fartyg, som gör det möjligt att studera neuronal skada oberoende av kärlskador. Å andra sidan, begränsar bristen på en hjärna användningen av C. elegans för att studera många aspekter av neurodegeneration. Dessutom kan reproduktionen och identifiering av anatomiska fördelningar av lesioner inte utföras i denna organism. Övriga gränsvärdensamheten inkluderar svårigheten att bedöma både skillnader i genuttrycksprofilerna och nedskrivning av komplexa beteende och minnesfunktion. Här beskriver vi metoder för att generera C. elegans modeller av amylopathies.

Protocol

Ett. Konstruktion av transgena maskarna Transformation. Förbered injektion pads. Placera en droppe av varm, 2% agaros löst i vatten, på ett täckglas. Placera snabbt ett andra täckglas på drop och knacka lätt det. Efter att agarosen stelnat, slide täckglas isär, och baka täckglas-pad i en vakuumugn vid 80 ° CO / N. Dra pipetter. Vi använder en Sutter P-97 avdragare för att dra 1/0.5 mm YD / ID borosilikatglas kapillärer med glödtråd. Pipetter är smidda med stängd spets som …

Representative Results

Med våra protokoll vi studera effekterna av humant Ap 42 oligomer på neuronal funktion 8. Ett fragment som kodar för humant Ap 42 och den artificiella signalpeptiden kodande sekvensen av Fire vektor pPD50.52 amplifierades från konstrukt PCL12 9 med användning av primrar som introducerade ett Smal ett restriktionsendonukleasställe i ändarna. Fragmentet infogades sedan i en konstruktion innehållande en 2481-bp flp-6 promotorsekvensen i pPD95.75 Fire vektorn mell…

Discussion

Här beskriver vi en kombinerad metod för att studera cellulära och molekylära aspekter av amylopathies med C. elegans. Fördelarna med detta tillvägagångssätt är:. 1) låg kostnad C.elegans bibehålls i normal Petriskål ympades med bakterier, vid rumstemperatur. 2) Kraftfulla genetik. Transgena djur kan erhållas på några månader och ett brett spektrum av promotorsekvenser är tillgänglig för att driva uttryck av den önskade genen i specifika neuroner. 3) Enkel, väldefinierad, nervsyste…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalog Number	Comments
			1. NGM
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Bacteriological agar	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-peptone	AMRESCO	J636	2.5 g
Distilled Water			Bring to 975 ml
			Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml of 1 M stock
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml of 1 M stock
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol)
Potassium phosphate buffer			25 ml of 1M stock
			2. Potassium phosphate buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	108.3 g
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	P3786	35.6 g
Distilled Water			Bring to 1 L
			Sterilized by autoclaving
			3. M9 buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml of 1 M stock
Distilled Water			Bring to 1 L
			Sterilized by autoclaving
			4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm)
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Distilled Water			Bring to 1 L
			Sterilized by autoclaving
			5. CM-15
L-15 culture medium	Gibco	11415	450 ml
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437-028	50 ml
Penicillin	Gibco	15140	50 units/ml
Streptomycin	Gibco	15140	50 g/ml
			Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C
			6. Other Reagents
Halocarbon 700 oil	Halocarbon Products	9002-83-9
5 μm Acrodisc Syringe Filter	PALL Co.	4199
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lectin (peanut)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S320
Lysine	Sigma-Aldrich	L5501
Biotin	Sigma-Aldrich	B4639
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044
Sodium azide	Sigma-Aldrich	71289
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389