La<em> Caenorhabditis elegans</em> Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy
Summary
Se describen métodos para estudiar los aspectos de la amylopathies en el gusano<em> C. elegans</em>. Mostramos cómo construir gusanos expresan Aß humano<sub> 42</sub> En las neuronas y la forma de poner a prueba su función en ensayos de comportamiento. Además, muestran cómo obtener cultivos neuronales primarios que pueden ser utilizados para las pruebas farmacológicas.
Abstract
Amylopathy es un término que describe la síntesis y la acumulación anormal de la proteína beta amiloide (Aß) en los tejidos con el tiempo. Aß es un sello distintivo de la enfermedad de Alzheimer (EA) y se encuentra en la demencia con cuerpos de Lewy, la miositis de cuerpos de inclusión y la angiopatía amiloide cerebral 1-4. Amylopathies desarrollan progresivamente con el tiempo. Por esta razón organismos simples con periodos de vida cortos pueden ayudar a dilucidar los aspectos moleculares de estas condiciones. A continuación, se describen los protocolos experimentales para el estudio de la neurodegeneración mediada por Aß usando el gusano Caenorhabditis elegans. Así, construimos gusanos transgénicos mediante la inyección de ADN que codifica Aß humano 42 en las gónadas sincitial de adultos hermafroditas. Líneas transformantes se estabilizan mediante una integración mutagénesis inducida. Los nematodos son la edad sincronizado mediante la recolección y la siembra de sus huevos. La función de las neuronas que expresan Aß 42 se prueba en ensayos de comportamiento oportunos (ensayo de quimiotaxiss). Cultivos neuronales primarios obtenidos a partir de embriones se utilizan para complementar los datos de comportamiento y para probar los efectos neuroprotectores de los compuestos anti-apoptóticas.
Introduction
Beta amiloide (Aß) es un péptido de 36-43 aminoácidos que se forma después de la escisión secuencial de la proteína precursora de amiloide (APP) por β y γ secretasas 1. La secretasa γ procesa el extremo C-terminal del péptido Aß y es responsable de sus longitudes variables 5. Las formas más comunes de Aß son Aß 40 y Ap 42, siendo esta última más comúnmente asociado a condiciones patológicas tales como 5 AD. A altas concentraciones de Aß forma β-hojas que se agregan para formar fibrillas amiloides 6. Depósitos de fibrillas son el principal componente de las placas seniles que rodean las neuronas. Ambas placas y difusibles, oligómeros Aß no la placa, se cree que constituyen las formas patogénicas subyacentes de Aß.
El estudio de laboratorio de amylopathies neuronales se complica por el hecho de que estas condiciones de progreso con el tiempo. Por lo tanto, es IMPORTANTESt para el desarrollo de animales genéticamente manejable modelos complementarios a los ratones-con vida corta. Estos modelos se pueden utilizar para elucidar aspectos específicos de amylopathies-típicamente celular y molecular y en virtud de su simplicidad, para ayudar a capturar la esencia del problema. El gusano Caenorhabditis elegans cataratas es esta categoría. Tiene una vida corta, ~ 20 días y, además, los procesos celulares básicos como la regulación de la expresión génica, el tráfico de proteínas, la conectividad neuronal, sinaptogénesis, la señalización celular y la muerte son similares a los mamíferos 7. Las características únicas del gusano incluyen la genética de gran alcance y la falta de un sistema de vasos, lo que permite estudiar el daño neuronal independientemente del daño vascular. Por otro lado, la falta de un cerebro limita el uso de C. elegans para estudiar muchos aspectos de la neurodegeneración. Además, la reproducción y la identificación de las distribuciones anatómicas de las lesiones no se pueden realizar en este organismo. Otro límiteciones incluyen la dificultad para evaluar tanto las diferencias en los perfiles de expresión génica y alteraciones de la conducta compleja y la función de la memoria. A continuación se describen los métodos para generar C. modelos elegans de amylopathies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un enfoque combinado, para estudiar los aspectos celulares y moleculares de amylopathies utilizando C. elegans. Las ventajas de este enfoque incluyen:. 1) bajo costo C.elegans se mantiene en la placa de Petri normal de sembrado con bacterias, a temperatura ambiente. 2) genética potentes. Los animales transgénicos pueden obtenerse en pocos meses y una amplia gama de secuencias de promotor está disponible para conducir la expresión del gen deseado en las neuronas específicas. 3), b…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. NGM | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 3 g |
| Bacteriological agar | AMRESCO | J637 | 17 g |
| Bacto-peptone | AMRESCO | J636 | 2.5 g |
| Distilled Water | Bring to 975 ml | ||
| Sterilized by autoclaving, then add the following items and mix well | |||
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 1 ml of 1 M stock |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C3045 | 1 ml of 5 mg/ml stock( in ethanol) |
| Potassium phosphate buffer | 25 ml of 1M stock | ||
| 2. Potassium phosphate buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 108.3 g |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P3786 | 35.6 g |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 3. M9 buffer | |||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | 3 g |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | 6 g |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 5 g |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | 1 ml of 1 M stock |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 4. Egg buffer (pH 7.3, 340 mOsm) | |||
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | 118 mM |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | 48 mM |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | 2 mM |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | 2 mM |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | 25 mM |
| Distilled Water | Bring to 1 L | ||
| Sterilized by autoclaving | |||
| 5. CM-15 | |||
| L-15 culture medium | Gibco | 11415 | 450 ml |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | 50 ml |
| Penicillin | Gibco | 15140 | 50 units/ml |
| Streptomycin | Gibco | 15140 | 50 g/ml |
| Adjust to 340 mOsm with sucrose then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C | |||
| 6. Other Reagents | |||
| Halocarbon 700 oil | Halocarbon Products | 9002-83-9 | |
| 5 μm Acrodisc Syringe Filter | PALL Co. | 4199 | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-5UN | |
| Lectin (peanut) | Sigma-Aldrich | L0881-10MG | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S320 | |
| Lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 71289 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 |
Riferimenti
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer’s disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
- Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
- Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
- Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer’s disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
- Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
- DL, R. i. d. d. l. e., et al. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. 1, 1222 (1997).
- Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
- Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
- Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
- Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
- Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
