A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

Summary

Intercelular Ca^{2 +}-Ondas são conduzidos por canais de junção gap e hemichannels. Aqui, descrevemos um método para medir intercelular Ca^{2 +}-Ondas em monocamadas de células em resposta a um estímulo mecânico de uma única célula local e sua aplicação a investigar as propriedades e regulação dos canais de junções gap e hemichannels.

Abstract

Comunicação intercelular é essencial para a coordenação dos processos fisiológicas entre as células de uma variedade de órgãos e tecidos, incluindo o cérebro, o fígado, a retina, na cóclea e vasculatura. Em condições experimentais, intercelular Ca ^{2 +-ondas} pode ser obtida através da aplicação de um estímulo mecânico para uma única célula. Isto conduz à libertação das moléculas sinalizadoras intracelulares de IP ₃ e Ca ^{2 +} que iniciam a propagação do Ca ^{2 +} onda concêntrica a partir da célula estimulada mecanicamente para as células vizinhas. As principais vias moleculares que controlam intercelular Ca ^{2 +} propagação de ondas são fornecidos por canais de derivação lacuna através da transferência direta de IP ₃ e por hemichannels através da liberação de ATP. A identificação e caracterização das propriedades de regulação e das diferentes isoformas de conexinas e pannexin como canais de junções de hiato e hemichannels são permitidas pelo quantification da disseminação intercelular do Ca ^{2 +} onda, siRNA, e o uso de inibidores dos canais de junções de hiato e hemichannels. Aqui, nós descrevemos um método para medir intercelular Ca ^{2 +} onda em monocamadas de células endoteliais da córnea primárias carregado com Fluo4-AM em resposta a um estímulo mecânico controlado e localizado provocado por uma deformação aguda de curta duração, da célula como resultado de tocar na membrana celular com uma micropipeta de vidro controlada por micromanipulador com um diâmetro de ponta de menos de 1 um. Descrevemos também o isolamento de bovinos células endoteliais corneanas primários e sua utilização como sistema modelo para avaliar a atividade Cx43-hemichannel como a força orientada para intercelular Ca ^{2 +-ondas} através da liberação de ATP. Finalmente, discute-se a utilização, vantagens, limitações e alternativas deste método no contexto do canal de junção gap e pesquisa hemichannel.

Introduction

Comunicação intercelular e de sinalização são essenciais para a coordenação dos processos fisiológicos em resposta aos agonistas extracelulares no tecido e nível de ^1,2-órgão inteiro. A maneira mais direta de comunicação intercelular é criado pela ocorrência de junções. Junções são placas de canais de junção gap, que são canais protéicos formados pelo acoplamento cabeça-de-cabeça de dois (Cx) hemichannels conexina de células adjacentes ^3,4 (Figura 1). Junções de hiato permitir a passagem de pequenas moléculas de sinalização, com um peso molecular de menos de 1,5 kDa, incluindo Ca ^{2 +} ou de IP ₃ ^5, causando modulação e Ca ^{2 +} de libertação a partir das reservas intracelulares das células vizinhas ⁶ (Figura 2). Canais de junções são fortemente regulados por intra e intermolecular interações proteína e por processos de sinalização celular, como modificação redox efosforilação ^7. GJS facilitar a resposta coordenada de células conectadas, agindo assim como um sincício elétrica e química. Por exemplo, a propagação do potencial de acção cardíaca entre os miócitos atriais e ventriculares é mediada pelos canais GJ baseados Cx ^85. Cxs não só tem um papel como canais de junções de hiato, mas também formar hemichannels desemparelhados, funcionando desse modo como os canais de membranas de forma semelhante aos canais de iões regulares ^8-10 (Figura 1). Hemichannels participar na sinalização parácrinas entre células vizinhas por controlar a troca de iões e moléculas de sinalização entre o ambiente intra-e extracelulares.

Em muitos tipos de células (como células epiteliais, células osteoblásticas, astrócitos, células endoteliais, etc) e órgãos (como o cérebro, o fígado, retina, cóclea e na vasculatura), intercelular Ca ^{2 +-ondas} são fundamentais para a coordenação das respostas multicelulares <sup> 11. Aumentos nos níveis de ^{Ca2 +} intracelular em células de um determinado não estão limitados a esta célula, mas para propagar as células vizinhas adjacentes, estabelecendo assim uma intercelular Ca ^{2 +} onda ^12,13. Estes intercelular Ca ^{2 +-ondas} são importantes para a regulação fisiológica normal de camadas de células como um sincício e sua desregulação tem sido associado com os processos patofisiológicos ^11. No endotélio corneano e epitélio, diferentes grupos ^14-24, incluindo o nosso próprio ^25-33, estudou os mecanismos e as funções de comunicação intercelular. Em células não-excitáveis, como as células endoteliais corneanas, dois modos distintos de comunicação intercelular ocorrer ^28,29, nomeadamente lacuna juncional comunicação intercelular e comunicação intercelular parácrina. Gap juncional comunicação intercelular envolve uma troca direta de moléculas de sinalização via junções gap ^7. Gap junccomunicação intercelular internacional é fundamental para a manutenção da homeostase do tecido, controle da proliferação celular, e estabelecer uma resposta sincronizada ao estresse extracelular ^10,34,35. Em uma série de patologias, acoplamento junção gap é reduzida devido à Cxs com defeito, e vem afetando lacuna juncional comunicação intercelular ^36. Isto enfatiza a importância ea influência do fosso juncional comunicação intercelular em organismos multicelulares. Em contraste com a abertura juncional comunicação intercelular, a comunicação intercelular parácrina não é dependente de aposição célula-célula, uma vez que implica a libertação de mensageiros extracelulares difusíveis (Figura 2). Diferentes tipos de moléculas sinalizadoras são libertadas no meio extracelular pelas células de sinalização. A molécula é então transportado para a célula alvo, onde é detectado por uma proteína receptor específico. Subsequentemente, o complexo receptor de sinal induz uma resposta celular, queé terminada por remoção do sinal, ou inactivação de dessensibilização. Lançamentos lipofílicos mensageiros de sinalização extracelular penetrar a membrana e agem sobre os receptores intracelulares. Em contraste, os mensageiros hidrofílicas não atravessar a membrana plasmática da célula responder, mas actuar como um ligando que se liga a proteínas receptoras expressas na superfície, que então retransmitem o sinal para o ambiente intracelular. Três grandes famílias de proteínas receptoras de superfície celular participar neste processo: canais de íons ligados, enzyme-linked e proteína G ligada. A molécula mensageira libertados podem actuar sobre os receptores da mesma célula (autócrino), sobre as células-alvo, em estreita proximidade (parácrina), ou nas células alvo distantes que exigem que o sistema circulatório (endócrina).

Em muitos tipos de células, incluindo endotélio corneano ^28,29, o ATP é um dos principais factores parácrinos, hidrofílicos que conduzem à propagação intercelular da ^{Ca2 +-ondas 37-40.} During deformação mecânica, a hipoxia, a inflamação ou a estimulação por vários agentes, o ATP pode ser libertado a partir de células saudáveis ^​​41-44, em resposta à tensão de corte, estiramento, ou inchaço osmótico ^44,45. Mecanismos de libertação de ATP diferentes têm sido postulada, incluindo exocitose vesicular ⁴⁴ e uma multiplicidade de mecanismos de transporte, tais como a cassete (ABC) transportadores de ligação a ATP, canais dependentes da voltagem aniónica plasmalemmal ⁴⁶ canais dos receptores P2X7, ^47,48, bem como conexina hemichannels ^49-52 e pannexin hemichannels ^43,49,53. O ATP extracelular pode ser rapidamente hidrolisado para o ADP, AMP e adenosina ^54,55 por ectonucleotidases que estão presentes no ambiente extracelular. O ATP extracelular liberado e seu metabólito ADP ⁵⁶ vai se espalhar por meio de difusão. A interacção subsequente destes nucleótidos com receptores purinérgicos nas células vizinhas tem sido implicada na propagation intercelular de Ca ^{2 +-ondas 28,37,51.} Duas classes diferentes de receptores purinérgicos estão presentes: adenosina é o principal ligando natural para P1-purinoceptors, enquanto ambos purina (ATP, ADP) e pirimidina (UTP, UDP) nucleótidos actuar em mais purinoceptors ^P2-57.

Comunicação intercelular pode ser investigada por vários métodos, tais como a carga raspagem, a transferência de corantes, uncaging locais de agonistas como _IP3 e Ca ^{2 +,} estimulação mecânica, etc. Aqui descrevemos o estudo de Ca ^{2 +} de propagação da onda induzida por estimulação mecânica de uma única célula. A vantagem de se estudar Ca ^{2 +} de propagação da onda de estimulação mecânica é que ela fornece uma ferramenta fácil de quantificar a propagação do Ca ^{2 +} onda ao longo do tempo e que permite comparar quantitativamente diferentes pré-tratamentos das células. Nas endotélio corneano, estes intercelular Ca ^{2 +-ondas} permitir um coresposta coordenada a partir da monocamada, actuando por este meio como um possível mecanismo de defesa do endotélio corneal não regenerativos ajudando o endotélio para suportar tensões extracelular durante a cirurgia intra-ocular, ou por exposição a mediadores inflamatórios, durante a rejeição imunológica ou uveíte ^58,59.

Protocol

1. Isolamento de células endoteliais da córnea Antes de começar: Isole as células dos olhos frescos, obtidos a partir de um matadouro local, logo que possível após a enucleação dos olhos. Certifique-se de que foi submetida à enucleação de uma vaca máximas de 18 meses de idade, cinco minutos após o abate e preservados em solução salina equilibrada de Earle – solução de iodo a 1% a 4 ° C durante o transporte para o laboratório. Pegue o olho de Solução Salina Bal…

Representative Results

Todos os experimentos são executados em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras e do protocolo que está sendo demonstrado é realizada sob a orientação e aprovação do comitê de cuidados com os animais e uso da KU Leuven. Em células endoteliais da córnea de bovino (BCEC), para junções de hiato funcionais e ambos são expressos lacuna juncional comunicação intercelular e comunicação intercelular parácrina contribuir significativamente para a c…

Discussion

Neste artigo, nós descrevemos um método simples de medir intercelular Ca ^{2 +} de propagação de ondas em monocamadas de células endoteliais corneanas bovinas primárias, fornecendo uma estimulação mecânica localizada e controlada usando uma micropipeta. Mecanicamente estimuladas células respondem com um aumento local intracelular _IP3 e Ca ^{2 +,} ambos os quais são moléculas de sinalização intracelular que conduzem essenciais intracelular de Ca ^{2 +} de propagação de o…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Column1
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14155-048
Iodine	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	38060-1EA
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	11960-044
L-glutamine (Glutamax)	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	35050-038
Amphotericin-B	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A2942
Antibiotic-antimycotic mixture	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	15240-096
Trypsin	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	25300-054
Dulbecco’s PBS	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	14190-091
Fluo-4 AM	Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)	F14217
ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP)	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A265
Apyrase VI	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6410
Apyrase VII	Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)	A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)	Custom peptide synthesis
Gap27 (SRPTEKTIFII)	Custom peptide synthesis
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)	Custom peptide synthesis
siRNA1 Cx43 (sense: 5’GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA2 Cx43 (sense: 5’CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5’GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT)	Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK)	Thermo Electron (Ulm, Germany)
Two chambered glass slides	Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)	155380
Confocal microscope	Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)	LSM510
Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	P-280
HVPZT-amplifier	PI Polytech (Karlsruhe, Germany)	E463 HVPZT-amplifier
Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)	World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA	4878
Microelectrode puller	Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)	WZ DMZ-Universal Puller