Whole Cell Patch Clamp voor Onderzoek naar de mechanismen van Infrarood Neural Stimulatie
Summary
Infrarood zenuwstimulatie is voorgesteld als een alternatief voor elektrische stimulatie in een reeks zenuw types, waaronder die gepaard gaan met het gehoorsysteem. Dit protocol beschrijft een patch clamp methode voor het bestuderen van het mechanisme van infrarood zenuwstimulatie in een kweek van primaire auditieve neuronen.
Abstract
Aangetoond is de laatste jaren dat gepulste, infrarood laserlicht kan worden gebruikt om elektrische reacties uitlokken in neuraal weefsel, onafhankelijk van de verdere modificatie van het doelweefsel. Infrarood zenuwstimulatie gerapporteerd in een verscheidenheid van perifere sensorische en neuraal weefsel in vivo, met weergegeven in stimulatie van neuronen in de gehoorzenuw bijzonder belang. Echter, terwijl de INS is aangetoond dat het werken in deze instellingen, het mechanisme (of mechanismen) waardoor infrarood licht veroorzaakt neurale excitatie is op dit moment niet goed begrepen. Het protocol hier gepresenteerde beschrijft een hele cel patch clamp methode ontwikkeld om het onderzoek van de infrarode neurale stimulatie in gekweekte primaire auditieve neuronen vergemakkelijken. Door grondig karakteriseren van de respons van deze cellen infrarode laser belichting in vitro onder gecontroleerde omstandigheden, kan het mogelijk zijn om een beter begrip van de fundamentele Physica krijgenl en biochemische processen die ten grondslag liggen infrarode neurale stimulatie.
Introduction
De velden van de neurofysiologie en de medische bionica sterk afhankelijk van technieken die regelbare stimulatie van elektrische reacties in zenuwweefsel kunnen. Terwijl elektrische stimulatie blijft de gouden standaard zenuwopwekplaatsen, lijdt aan een aantal nadelen, zoals de aanwezigheid van stimulatie artefacten bij het opnemen neurale respons, en een gebrek aan stimulatie specificiteit door de verspreiding van stroom in omringende weefsel 1.
De laatste twee decennia hebben de ontwikkeling van optisch gemedieerde stimulatie technieken 2 gezien. Een aantal van deze technieken vereisen aanpassing van het doelweefsel, via de toevoeging van een bepaald molecuul (bijv. gekooide moleculen) 3 of enige vorm van genetische manipulatie (bijv. optogenetics) 4, die geen van beide gemakkelijk buiten onderzoeksverband te passen. Van bijzonder belang is dan ook infrarood neurale stimulatie (INS), whereby zenuwweefsel wordt opgewekt door gepulseerd infrarood laserlicht. INS heeft de potentie om veel van de tekortkomingen van elektrische stimulatie overwinnen doordat zeer specifieke, contactloze stimulatie van zenuwweefsel 2. Hoewel INS met succes aangetoond in diverse instellingen in vivo, het precieze mechanisme van excitatie blijft onzeker.
Enkele recente publicaties hebben aangetoond vooruitgang naar het blootleggen van het mechanisme achter INS 5-7. Snelle verwarming als gevolg van absorptie van het laserlicht door het water lijkt een belangrijke rol te spelen. Daarnaast echter een consensus nog worden bewerkstelligd. Shapiro et al.. 7 stellen een zeer algemeen mechanisme waarmee snel verwarmen veroorzaakt een verstoring in de verdeling van geladen deeltjes naast de celmembraan, wat leidt tot een verandering in de capaciteit van de celmembraan en daaropvolgende depolarisatie. Bovendien Albert et al.. 5 beweren dat laser geïnduceerde verwarming activeert een specifieke klasse van temperatuurgevoelige ionkanalen (transient receptor potential vanilloid kanalen), waardoor ionen om door het celmembraan. In dit stadium is het onduidelijk hoe deze mechanismen te combineren, of zelfs of er andere factoren die nog moeten worden geïdentificeerd.
Hoewel een klein aantal publicaties (referenties 5,7-9) INS hebben in vitro onderzocht, heeft de overgrote meerderheid van het werk gepubliceerd op dit gebied is uitgevoerd in vivo (bv. referenties 1,6,10-18). Infrarode stimulatie van de auditieve neuronen is een gebied van bijzonder belang, gezien de potentiële toepassingen in cochleaire implantaten 10,14-18. Terwijl in vivo experimenten zijn belangrijk voor de effectiviteit van de techniek in verschillende instellingen, over de toegenomen geboden door in vitro studies controle naar verwachting leiden tot een meer gedetailleerd begrip van de mech controlerennisme verantwoordelijk voor de INS. Dit rapport beschrijft de bereiding van gekweekte ganglion spirale neuronen voor patch clamp onderzoeken, omdat deze kunnen worden gebruikt om fundamentele mechanismen bestuderen tegelijkertijd verbinden met de grote hoeveelheid bestaande gegevens uit het gehoorsysteem.
De patch clamp techniek is een uitstekend hulpmiddel voor het onderzoeken van elektrofysiologische fenomenen, een middel van het opnemen van elektrische activiteit in enkele cellen en het bestuderen van de bijdrage van de individuele onderliggende stromingen 19. Wanneer deze techniek wordt toegepast op een stabiele in vitro bereiding van primaire neuronen, zoals gekweekte ganglion spirale neuronen, biedt de mogelijkheid te bestuderen in de mechanismen waardoor neurale activiteit wordt gecontroleerd en gemanipuleerd diepte.
De in dit werk schema onderzoeken van het effect van laserstimulatie op de elektrische eigenschappen van de ganglion spirale neuronen door patch clamp protocollenopnames. De benadering is gebaseerd op een vezel-gekoppelde laser in plaats van een vrije ruimte laser, waardoor veiliger werken en gemakkelijker en herhaalbare uitlijning zonder de standaard microscoop configuratie te wijzigen. Op grond van deze protocollen, moet het mogelijk zijn een groot aantal experimenten om meer duidelijk het mechanisme of mechanismen achter INS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van de in deze paper protocollen is het mogelijk om uit te pakken en cultuur spiraal ganglion neuronen en laser-opgewekte elektrische activiteit te onderzoeken door hele cellen patch clamp experimenten uitvoeren. Bij gebruik in vitro, de patch clamp techniek geeft een mate van controle over de experimentele parameters die niet haalbaar in vivo. Laserstimulatie parameters zoals golflengte, pulsenergie, pulslengte, pulsvorm, en pulsherhalingsfrequentie sequenties kunnen worden onderzocht in ee…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Australische Raad voor Onderzoek onder Linkage Project subsidie LP120100264.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. |
Riferimenti
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -. M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscienze. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. . Optical Waveguide Theory. , (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
