赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ
Summary
赤外線神経刺激は、聴覚系に関連するものを含む神経種類の範囲内の電気刺激の代替として提案されている。このプロトコルは一次聴覚神経細胞の培養における赤外線神経刺激のメカニズムを研究するためのパッチクランプ法を説明しています。
Abstract
なお、パルス、赤外レーザ光が標的組織の更なる変形例の独立した神経組織の電気応答を誘発するために使用することができる近年では実証されている。赤外線神経刺激は、聴覚神経の神経細胞の刺激に示される特定の関心と、in vivoで末梢および感覚神経組織の様々報告されている。 INSは、これらの設定で動作するように示されているがしかし、赤外光は、神経興奮を引き起こすする機構（または機構）は、現在よく理解されていない。ここで紹介するプロトコルは、初代培養ニューロンにおける聴覚赤外線神経刺激の調査を容易にするように設計された全細胞パッチクランプ法が記載されている。十分に制御された条件下でin vitroでの赤外レーザ照射に対するこれらの細胞の応答を特徴付けることで、基本的な物理学会の改善された理解を得ることも可能であるlおよび生化学的プロセスは、赤外線神経刺激の基礎となる。
Introduction
神経生理学や医療バイオニクスの分野では、神経組織の電気応答の制御可能な刺激を可能な技術に大きく依存しています。電気刺激は、神経興奮で金本位まま神経応答、および組織1を取り巻くへの電流の広がりに起因する刺激の特異性の欠如を記録するとき、そのような刺激アーチファクトの存在など多くの欠点に悩まされる。
最後の二十年は、光学的に媒介刺激技術の開発2を見てきました。これらの技術のいくつかは、どちらも、いずれかの特定の分子を添加する（ 例えば、ケージ分子）3または遺伝子操作（ 例えば、光遺伝学）4のいくつかのフォームを、標的組織の変更を必要とする研究の設定の外側に適用することが容易である。特に興味深いのは、そのため赤外線神経刺激（INS）、wherebですyは神経組織、パルス赤外レーザ光により励起される。 INSは、神経組織2の高度に特異的な、非接触刺激を可能にすることで、電気刺激の欠点の多くを克服する可能性を秘めている。 INSが正常にin vivoでのさまざまな設定で実証されているがしかし、励起の正確なメカニズムは不明である。
最近の出版物は5-7 INSのメカニズムを解明に向けた進展を示している。水によるレーザ光の吸収による急速加熱が重要な役割を果たすと思われる。しかし、これを超えてコンセンサスがまだ到達しなければならない。シャピロら 7は、急速加熱が、細胞膜およびその後の脱分極の静電容量の変化をもたらす、細胞膜に隣接する荷電粒子の分布の摂動を引き起こすことにより、非常に一般的なメカニズムを提案する。また、アルバートら 5はそのLASE を主張rを誘発加熱イオンが細胞膜を通過させ、温度感受性イオンチャネル（一過性受容体電位バニロイドチャネル）の特定のクラスを活性化する。この段階では、これらのメカニズムはまだ同定されている更なる要素があるかどうかを実際に組み合わせる、またはどのように不明である。
出版物の少数の（参考文献5,7-9） インビトロで INSを調査してきたが、この分野で公開され、作業の大部分は（ 例えば、参照1,6,10-18） インビボで行われている。聴覚ニューロンの赤外線刺激は人工内耳10,14-18の潜在的なアプリケーションに起因し、特に関心のある領域、となっています。 in vivoでの実験では様々な設定での技術、 試験管内試験ではによって与えられる制御の増加レベルメカのより詳細な理解につながることが期待されての有効性を検証することが重要である一方INSの責任anism。このレポートには、これらも聴覚系から既存データの大本体に連結しながら基本的なメカニズムを研究するために使用することができるように、パッチクランプ調査培養らせん神経節ニューロンの調製を記載する。
パッチクランプ法は、単一細胞における電気的活動を記録する手段を提供し、個々の基礎となる電流19の寄与を研究し、電気生理学的現象の調査のための優れたツールである。この技術は、例えば培養された螺旋神経節ニューロンの一次ニューロンのin vitroにおける安定調製に適用される場合には、深さが神経活性が制御され、操作されるメカニズムを研究する機会を提供する。
パッチクランプを通してらせん神経節ニューロンの電気的特性に及ぼすレーザー刺激の効果を調査するため、この作業のアウトライン法で指定されたプロトコルレコーディング。アプローチは、標準的な顕微鏡の構成を変更することなく安全な操作だけでなく、より簡単かつ再現性の配向を可能にする、ファイバ結合レーザではなく、自由空間レーザに基づいている。これらのプロトコルに基づいて、それがより明確にINSのメカニズムまたは機構を決定するために実験の広い範囲を行うことが可能であるべきである。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文で概説プロトコルを使用すると、それは抽出して文化らせん神経節ニューロンと全細胞パッチクランプ実験を行うことにより、レーザー誘発電気的活動を調査することが可能である。 インビトロで使用される場合、パッチクランプ法は、 インビボでは達成できない実験パラメータの制御のレベルを提供する。このような波長、パルスエネルギー、パルス長、パルス形状?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、リンケージプロジェクト助成LP120100264下オーストラリアリサーチ評議会によってサポートされていました。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. |
Riferimenti
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