Whole Cell Patch Clamp för att undersöka mekanismer Infraröd nervstimulering
Summary
Infraröd nervstimulering har föreslagits som ett alternativ till elektrisk stimulering i en rad nerv slag, inbegripet sådana som sammanhänger med hörselsystemet. Detta protokoll beskriver en metod patch clamp för att studera mekanismen av infraröd nervstimulering i en kultur av primära auditiva neuroner.
Abstract
Det har visats under senare år att pulsad, infraröd laser ljus kan användas för att framkalla elektriska svar i neural vävnad, oberoende av någon ytterligare modifiering av målvävnaden. Infraröd neural stimulering har rapporterats i ett flertal perifert och sensorisk neural vävnad in vivo, med särskilt intresse visas i stimulering av nervceller i hörselnerven. Men medan INS har visat sig fungera i dessa inställningar, är mekanismen (eller mekanismer) genom vilken infrarött ljus orsakar neural excitation tillfället inte väl förstådd. Protokollet presenteras här beskriver en hel cell metod patch clamp utformad för att underlätta utredningen av infraröd neural stimulering i odlade primära hörselneuronerna. Genom att noggrant karakterisera svaret av dessa celler till infraröd laser belysning in vitro under kontrollerade förhållanden, kan det vara möjligt att få en bättre förståelse av den fundamentala physical och biokemiska processer som ligger bakom infraröd neural stimulering.
Introduction
Områdena neurofysiologi och medicinsk bionics starkt beroende av teknik som möjliggör kontrollerbar stimulering av elektriska svar i nervvävnad. Medan elektrisk stimulering förblir guldmyntfoten i neural excitation, lider den av ett antal nackdelar, såsom förekomsten av stimulans artefakter vid inspelning neurala reaktioner, och brist på stimulans specificitet på grund av spridningen av strömmen till omgivande vävnad 1.
De senaste två decennierna har utvecklingen av optiskt medierade stimulering tekniker 2. Flera av dessa tekniker kräver modifiering av målvävnaden, antingen genom tillsats av en särskild molekyl (t.ex. caged molekyler) 3 eller någon form av genetisk manipulation (t.ex. optogenetics) 4, varken som är lätta att tillämpa utanför en forskninginställning. Av särskilt intresse är därför infraröd neural stimulering (INS), whereby nervvävnad exciteras av pulsad infraröd laser ljus. INS har potential att övervinna många av bristerna i elektrisk stimulering genom att möjliggöra mycket specifika, icke-kontakt stimulering av nervvävnad 2. Men medan INS har framgångsrikt visat i en mängd olika inställningar i vivo, förblir den exakta mekanismen för excitation osäker.
Några aktuella publikationer har visat framsteg mot att upptäcka mekanismen bakom INS 5-7. Snabb uppvärmning på grund av absorption av laserljuset av vatten verkar spela en nyckelroll. Men utöver detta konsensus är ännu inte uppnått. Shapiro et al. 7 föreslå en mycket generell mekanism varigenom snabb uppvärmning orsakar en störning i fördelningen av laddade partiklar angränsande till cellmembranet, vilket leder till en ändring av kapacitansen av cellmembranet och efterföljande depolarisation. Dessutom Albert et al. 5 hävda att laser inducerad uppvärmning aktiverar en specifik klass av temperaturkänsliga jonkanaler (transient receptor potential vanilloid kanaler), så att joner att passera genom cellmembranet. I detta skede är det oklart hur dessa mekanismer kombineras, eller om huruvida det finns ytterligare faktorer som ännu inte identifierats.
Även om ett litet antal publikationer (referenser 5,7-9) har undersökt INS in vitro, har den stora majoriteten av arbetet publiceras i detta område utförts in vivo (t.ex. referenser 1,6,10-18). Infraröd stimulering av hörselneuronerna har varit ett område av särskilt intresse på grund av de potentiella tillämpningar inom cochleaimplantat 10,14-18. Medan in vivo-experiment är viktigt att kontrollera effektiviteten av tekniken i olika miljöer, den ökade nivån av kontroll följer av in vitro-studier förväntas leda till en mer detaljerad förståelse av mechningsmekanismen ansvarar för INS. Denna rapport beskriver framställningen av odlade nervceller spiral ganglion för utredningar patch clamp, eftersom dessa kan användas för att studera grundläggande mekanismer och samtidigt länka till den stora kroppen av befintliga data från hörselsystemet.
Plåstret clamp-tekniken är ett utmärkt verktyg för undersökningar av elektrofysiologiska fenomen, skapar en möjlighet att registrera den elektriska aktiviteten i enstaka celler och studera bidraget för de enskilda underliggande strömmarna 19. När denna teknik används på ett stabilt in vitro framställning av primära neuroner, såsom odlade nervceller spiral ganglion, det ger möjlighet att studera på djupet genom vilka mekanismer neural aktivitet kontrolleras och manipuleras.
Protokollen i detta arbetssätt disposition för att undersöka effekten av laser stimulering på de elektriska egenskaperna hos nervceller spiral ganglion via patch clampinspelningar. Systemet är baserat på en fiber-kopplad laser snarare än ett fritt utrymme laser, vilket säkrare drift samt enklare och mer repeterbar anpassning utan behovet att ändra standard mikroskop konfigurationen. På grundval av dessa protokoll, bör det vara möjligt att genomföra en mängd olika experiment för att tydligare fastställa mekanismen eller mekanismerna bakom INS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Använda de protokoll som beskrivs i detta dokument är det möjligt att utvinna och kultur spiral nervceller ganglion och utreda laser-framkallade elektriska aktiviteten genom att utföra helcells experiment patch clamp. Vid användning in vitro, tillhandahåller patch clamp-tekniken en nivå av kontroll över experimentella parametrar som inte kan uppnås in vivo. Laser stimulering parametrar som våglängd, puls energi, pulslängd, pulsformen och pulssekvenserna upprepning kan studeras på ett repro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Australian Research Council i Linkage Projektbidrag LP120100264.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials and equipment | |||
| Glass coverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring cell culture dish | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Curved forceps | WPI | 14101 | Dumont #5 tweezers (45° angle tip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Table 1. Cell culture materials and equipment. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-free supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellular solution | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Potassium hydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellular solution | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sodium hydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution. | |||
| Upright microscope | Zeiss | AxioExaminerD1 | Equipped with Dodt contrast |
| Water-immersion objective | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform and X-Y stage | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibration isolation table | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| In-line solution heater | Warner | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipette glass | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicate glass with filament |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Recording Software | AxoGraph | Lab pack and electrophysiology tools | |
| Aspirator bottle | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing |
| PE Tubing | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltic pump | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Table 3.Patch clamp equipment. | |||
| 1,870 nm laser diode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA |
| Optical fiber through connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optical fiber cleaver | EREM | FO1 | |
| Optical fiber stripping tool (0.25 – 0.6 mm) | Siemens | For removing optical fiber jacket | |
| Optical fiber stripping tool (0.6 – 1.0 mm) | Siemens | For removing outer coating of patch cord | |
| Signal generator | Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered | ||
| Optical fiber positioner | Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments | ||
| Optical fiber chuck | Newport | FPH-DJ | |
| Laser power meter and detector head | Coherent | FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head) | |
| Table 4. Laser equipment. |
Riferimenti
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003 (2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
- Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
- Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Bec, J. -. M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
- Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
- Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
- Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
- Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
- Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
- Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008 (2007).
- Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
- Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
- Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
- Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
- Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscienze. 138, 653-662 (1016).
- Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
- Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685 (2010).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002 (2012).
- Snyder, A. W., Love, J. D. . Optical Waveguide Theory. , (1983).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
- Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).
