Multimodalitet imaging är en värdefull metod för att studera bakteriell kolonisation i små djurmodeller. Detta protokoll beskriver infektion hos möss med självlysande<em> Citrobacter rodentium</em> Och den längsgående övervakning av bakteriell kolonisering med komposit 3D diffus tomografi ljus avbildning med μCT bildbehandling för att skapa en 4D film av<em> C. rodentium</em> Infektion.
Detta protokoll beskriver de steg som krävs för att longitudinellt följa en självlysande bakteriell infektion med komposit 3D diffus tomografi ljus avbildning med integrerad μCT (DLIT-μCT) och den efterföljande användningen av dessa data för att generera en fyrdimensionell (4D) film av infektionen cykeln. Att utveckla 4D infektion filmer och att validera DLIT-μCT avbildning för bakterieinfektion studier med en IVIS Spectrum CT, använde vi infektion med självlysande C. rodentium, som orsakar självbegränsande kolit hos möss. I detta protokoll, beskriva vi infektionen hos möss med självlysande C. rodentium och non-invasiv övervakning av kolonisering av daglig DLIT-μCT imaging och bakteriell uppräkning från avföring för 8 dagar.
Användningen av IVIS Spectrum CT underlättar sömlös samtidig registrering av optiska och μCT skanningar med en enda avbildning plattform. Den låga dosen μCT modalitet möjliggör avbildning av mössvid flera tidpunkter under infektion, som ger detaljerad anatomisk lokalisering av självlysande bakterie härdar i 3D utan att orsaka artefakter från den kumulativa strålningen. Viktigt är 4D filmer av infekterade möss ger ett kraftfullt analysverktyg för att övervaka bakteriekolonisation dynamik in vivo.
Små djurmodeller, i synnerhet de som utnyttjar möss, används rutinmässigt för att undersöka bakteriell patogenes eller testa åtgärdsstrategier för infektioner, såsom antibiotika, probiotika, prebiotika och vacciner 1-7. De viktigaste experimentella readouts från små djur infektioner är patogen belastning, spatial och temporal lokalisering av infektionen, och förändringar i immunsvaret hos den infekterade organismen. In vivo optisk imaging är ett värdefullt verktyg för infektionssjukdomar forskning och kan användas för att övervaka flera experimentella avläsning genom användning av reportergener (luciferas, fluorescerande proteiner, beta-laktamas, etc), fluorescerande färgämnen, nanopartiklar eller kemiluminiscerande prober riktade till ett protein, biologisk process, eller en mikroorganism 6.
Bioluminescence imaging (BLI) är en optisk avbildning modalitet som används för att övervaka kolonisering av små djur, såsom möss och råttor, genom patogena bakterieria 3,6,8,9. Möss infekterade med rekombinanta bakterier som uttrycker en luciferas, såsom lux CDABE operonet från Photorhabdus luminescens. Kan dessa bakterier sedan detekteras genom deras ljus produktion använder en CCD baserad in vivo imaging system 3,6,9. Viktigt endast metaboliskt aktiva mikroorganismer är självlysande (BL), vilket endast livsdugliga bakterieceller detekteras genom denna metod 10,11. Använda 2D BLI, placeringen av BL källan härledas från ytan av djuret där signalen ljuder 8. Den exakta anatomiska lokalisering av BL härdar in vivo måste bestämmas genom ex vivo analys av organ 3,6,9 Däremot kan sammansatta 3D diffust ljus imaging tomografi (DLIT) användas för att sammanställa en kvantitativ 3D rekonstruktion av BL källa 12. DLIT utförs genom att samla BL tagna bilder med definierade smala bandpass-optiska filter ochdärefter inmatning av dem i en diffus optisk tomografi 3D rekonstruktionsalgoritm 1,7,12,13.
För närvarande, är multi-modalitet avbilda den enda metod som finns tillgänglig för att få verklig icke-invasiv anatomisk lokalisering av självlysande foci in vivo utan behov av ex vivo-analys. Nyligen använde vi en kombination av DLIT co-registrerade μCT imaging att utvärdera Citrobacter rodentium (C. rodentium) kolonisering dynamik efter profylaktisk behandling med en probiotisk bakterie 7. C. rodentium är en mus specifik enterisk patogen som används för att modellera mänsklig infektion med enteropatogena och enterhemorrhagic Escherichia coli 14. C. rodentium infektion orsakar kolit, vanligtvis förknippas med mild viktminskning, diarré, polariserade Th1 immunsvar och distinkta patologiska förändringar, inklusive kolon kryptan hyperplasi och fästa och effacing lesion formatiden 14. Utöver detta, C. rodentium patogenes har studerats ingående med hjälp BLI och dess dynamik kolonisering i C57BL/6J-möss är väl dokumenterade, vilket gör denna bakterie en idealisk modell mikroorganism för användning med multimodalitet imaging 3,4,7.
Detta protokoll är det första att beskriva en metod för samordnad DLIT-μCT avbildning av en bakteriell infektion med en enda plattform multimodalitet imaging, IVIS Spectrum CT, samt generering av en 4D film som visar den verkliga dynamiken i denna infektion icke-invasivt.
Den 4D film av bakteriell infektion ger ett användbart verktyg för att visualisera och tolka stora mängder av multimodalitet imaging data snabbt och enkelt. Denna teknik underlättar detaljerad analys av hur en infektion sprids genom en individuell mus och kan användas för att undersöka hur borttagning av värd eller bakteriella gener eller särskilda strategier ingripande verkan bakteriehalten, distribution och lokalisering vid en longitudinell studie 7. Dessa filmer ger också användbara läromedel och ett sätt att sprida information till allmänheten.
Det finns flera viktiga steg i detta protokoll som kan påverka kvaliteten på de uppgifter som erhållits från DLIT-μCT bildbehandling och förmågan att sammanställa en 4D video för infektion. Den viktigaste delen av detta protokoll är den framgångsrika och homogen infektion av möss med C. rodentium. Det är väsentligt att de möss som användes för studien är mellan 18 till 20 g och att bakterieella inoculums är nygjord och cirka 5 x 10 9 CFU, som beskrivits tidigare 2,3. Före infektion av mössen är det viktigt att kontrollera att ympen är självlysande med Spectrum CT och när ympen har upprättats, måste den ständigt homogeniseras innan varje mus sondmatades att mössen få liknande infektiösa doser. Den DLIT-μCT avbildning av möss har optimerats så att den automatiska exponeringen fungerar i Living Image 4.3.1 automatiskt bestämmer optimerade imaging parametrarna för signalen att vara väl över bruset. Dock bygger den automatiska exponeringen fungerar på användardefinierade inställningar och parametrar som måste modifieras som beskrivs i proceduren. Underlåtenhet att göra detta kommer att resultera i dåliga bilder med ett lågt antal fotoner samlats som inte leder till en uppenbar progression i infektionen, eftersom Spectrum CT fabriksinställningar för exponeringsautomatiken är programmerade för avbildning tumörer som uttryckereldflugeluciferas. Rekonstruktioner utföras med 560-620 nm ger den bästa överenskommelsen mellan simulerade och uppmätta data, och därför är de mer tillförlitliga data som ska inkluderas i återuppbyggnaden.
En begränsning till användningen av DLIT-μCT är att joniserande strålning från μCT scan orsakar subletal strålningsskador som är kumulativ över en longitudinell studie 18. Sub-dödande strålningsexponering kan försvaga immunförsvaret, orsaka DNA-skada, och apoptos i inre organ 19. Ytterst kan kumulativa subletal strålningsskador orsaka dödsfall om LD 50/30 för joniserande strålning överskrids, vilket är mellan 5 till 7 Gy beroende på musstammen och ålder av mössen använde 18,20,21. Även om en del av den molekylära skador från joniserande strålning kan läka, eftersom den övergripande principen är att uppskatta dos konservativt, är detta inte normalt redovisas i studieplanering. Istället är målet att hålla sig så långt belOW dessa gränser som möjligt samtidigt utföra de studiemål. Detta är särskilt viktigt i denna studie på grund av det normala immunsvaret på infektion, kan frekvensen för bildframställning, och det faktum att transgena, immunblot-bestod, eller kraftigt infekterade djur vara mer mottagliga för joniserande strålning.
Vid planering av experiment för att skapa en 4D film av infektion, är det viktigt att beakta längden av experimentet, skannar antalet μCT krävs under denna period och LD 50/30 för joniserande strålning för musstammen används. En annan potentiell begränsning till DLIT-μCT är styrkan reportern uttryck inom den bakteriestam som används, eftersom detta kommer att påverka bakteriella detektionsgränser och tider avbildning. Det rekommenderas starkt att forskare använder validerade bakteriestammar som är fullt virulent, men optimerad för maximal lux-operon uttryck, vilket visas tidigare för BLI2,3.
Ett varningens ord till den nuvarande utformningen av 4D avbildning är att varje film består av enskilda DLIT-μCT skanningar som har olika fotonen skalning. Detta kan göra bilderna svårtolkade om ändringar i lokaliseringen av BL härdar, eller dess intensitet är subtila, eller om det finns en intensiv BL fokus omgiven av flera svaga foci. Därför, för längsgående visualiseringar, är det viktigt att hålla färgfälten konsekvent mellan tidpunkterna.
Begreppet en 4D film av infektion kan tillämpas på någon lämpligt etiketterad bakteriell patogen. Framtida utveckling av denna teknik kommer att sträva efter att använda fluorescens avbildning tomografi (FLIT) samt DLIT att underlätta utredningen av värdens svar på infektion med en kombination av självlysande bakteriella patogener och injicerbara fluorescerande nära infraröda prober för att undersöka värd svar på infektion. Utöver detta, i detta protokoll vi barabeskriver användningen av självlysande bakterier för att skapa 4D filmer av infektion. Men i vissa fall kan det vara nödvändigt att använda fluorescensmärkta bakterier, t ex taggade med IRFP, så att bioluminescens reportern kan användas för att undersöka värd genetik under infektion. Huvudsakligen kommer användningen av multimodalitet imaging kombinerar DLIT / FLIT-μCT tillåter oss att icke-invasivt undersöka flera parametrar under en bakteriell infektion, vilket kommer att bidra avsevärt till att minska, förfina och ersätta användningen av djur i vetenskaplig forskning som beskrivs i NC3R initiativ ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).
The authors have nothing to disclose.
Den in vivo imaging anläggning vid Imperial College finansierades av MRC.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Bioluminescent C. rodentium | Frankel lab | ICC180 | Wiles et al., 2004 |
Veet | Boots | Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well. | |
Isofluorane (100% v/v) | Abbott | B506 | |
Medical Oxygen | BOC Medical | Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required. | |
Luria Bertani broth | Merck | 1.10285.0500 | 25 g in 1L Demineralised water. |
Luria Bertani agar | Merck | 1.10283.0500 | 37 g in 1L Demineralised water. |
Kanamycin sulphate | Sigma (Fluka) | 60615 | |
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes | BD (Falcon) | 352070 | |
Universals | Corning (Gosselin) | E5633-063 | |
1 ml syringe | BD (Plastipak) | 300013 | |
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved | Vet Tech | DE005 | |
Microbanks (Cryovial) | Pro-Lab Diagnostics | PL.170/Y | |
IVIS Spectrum CT | Caliper- a PerkinElmer Company | 133577 Rev A/ Spectrum CT | |
6kVA UPS | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
XGI-8 anesthesia system | Caliper- a PerkinElmer Company | 118918 | |
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal | Caliper- a PerkinElmer Company | 118999/00 | |
Living Image v4.3.1 SP1 | Caliper- a PerkinElmer Company | ||
Benchtop shaking incubator | New Brunswick Scientific | Innova 44 |