Adenovirale Transduktion von Naive CD4 T-Zellen zu Treg Differenzierung Studieren
Summary
Adenovirale Gentransfer in naiven CD4-T-Zellen mit transgenen Expression des Coxsackie Adenovirus-Rezeptor ermöglicht die molekulare Analyse von regulatorischen T-Zell-Differenzierung<em> In vitro</em>.
Abstract
Regulatorische T-Zellen (Tregs) sind unerlässlich, um Immuntoleranz auf Selbstbestimmung sowie auf bestimmte fremde Antigene zu präsentieren. Tregs kann von naiven CD4 + T-Zellen in vitro mit TCR-und Co-Stimulation in Gegenwart von TGF-und IL-2 erzeugt werden. Dies birgt ein enormes Potenzial für zukünftige Therapien, aber die Moleküle und Signalwege, die Kontrolle Differenzierung sind weitgehend unbekannt.
Primären T-Zellen können durch ektopische Expression manipuliert werden, aber üblichen Verfahren nicht die wichtigste naive Zustand der T-Zelle vor dem primären Antigen-Erkennung anzusprechen. Hier bieten wir ein Protokoll zu ektopische Gene in naiven CD4 T-Zellen exprimieren in vitro vor Induktion Treg Differenzierung. Es gilt Transduktion mit der Replikation-Adenovirus und erklärt, seine Erzeugung und Produktion. Das Adenovirus kann bis große Einsätze (bis zu 7 kb) und kann mit Promotoren ausgestattet werden, um hohe und vorübergehende Überbel erreichenression in T-Zellen. Es wandelt effektiv naive T-Zellen der Maus, wenn sie eine transgene Coxsackie Adenovirus-Rezeptor (CAR) auszudrücken. Wichtig ist, dass nach der Infektion die T-Zellen bleiben naive (CD44 niedrig, CD62L hoch) und Ruhe-(CD25 -, CD69 -) und kann aktiviert und in Tregs differenziert werden ähnlich nicht-infizierten Zellen. Somit ermöglicht dieses Verfahren Manipulation von CD4 T-Zell-Differenzierung von Anfang an. Es sorgt dafür, dass ektopische Genexpression ist bereits in Kraft, wenn sie früh signalisiert Ereignisse des ersten TCR Stimulation induziert zelluläre Veränderungen, die schließlich in Treg Differenzierung führen.
Introduction
Tregs sind entscheidend für die Immuntoleranz zu halten und überschießenden Immunreaktionen dämpfen. Tregs unterdrücken Zuschauer T-Zell-Aktivierung. Folglich führt Ablation von Tregs zu tödlichen Autoimmunität und Selbstzerstörung durch aktivierte T-Zellen 1 angetrieben. Tregs im Thymus entwickeln während negative Selektion von CD4-positiven einzigen Vorstufen, aber sie können auch in der Peripherie zu unterscheiden von naiven CD4 + T-Zellen bei niedriger Dosis Antigen-Stimulation mit suboptimalen Kostimulation 1,2. Thymic Tregs scheinen Gewebe Autoimmunität gegen Selbst-Antigene zu unterdrücken, während peripheren Tregs bei der Bereitstellung von Toleranz im Darm oder der Lunge in Verbindung gebracht haben. Diese induzierten Tregs potently verhindern T-Zell-Aktivierung nach Anerkennung ausländischer Antigene in der Schleimhaut, einschließlich Umwelt-Antigenen aus Nahrung und Luft, symbiotischer Bakterien, Allergene und 3,4. Darüber hinaus sind Tregs entscheidend für mütterliche Toleranz gegenüber fetalen Peptide 5 zu etablieren und vormontiertEntlüftung graft-versus-host disease 6. Zur gleichen Zeit, Tregs vermitteln auch unerwünschte Effekte durch Dämpfung Immunüberwachung von Tumorzellen 7,8. Das Erkennungsmerkmal der Tregs ist der Ausdruck der Teilmenge-Angabe Transkriptionsfaktor Foxp3, eine Gabel-Kopf-domain-containing Transkriptionsfaktor, der notwendig und ausreichend verleihen Treg-Funktion ist 9,10. Einige Signalwege, die Foxp3-Expression zu induzieren können, sind bekannt. Allerdings sind die molekularen Prozesse, die steuern, regulieren, modulieren oder Treg Differenzierung in Antwort auf T-Zell-Rezeptor auslöst weniger gut verstanden.
Tregs sehr effektiv in vitro durch die Stimulierung der naiven CD4 T-Zellen mit anti-CD3 und anti-CD28-Antikörper in Gegenwart von TGF-2 und IL 11 ausgelöst werden. Da die Schwellenländer Tregs in vivo, die Manipulation von Molekülen, die Treg Differenzierung zu fördern sind funktional trägt enormes Potential für zukünftige therapies z. B. die Behandlung von Asthma, Morbus Crohn, und Transplantation 11,12. Umgekehrt kann therapeutische Modulation von Molekülen an Treg Differenzierung blockieren bieten Nutzen in Zukunft Ansätze der kombinierten Behandlung von Tumorpatienten.
In vitro Differenzierung Assays sind für die Beschreibung der molekularen Veränderungen, die mit T-Zell-Untergruppe Differenzierung verbunden sind maßgeblich. Im Moment, experimentelle Versuche, Suche oder Bildschirm für die Gen-Produkte, die Kontroll-T-Zell-Differenzierung durch die Tatsache, dass die häufigsten Methoden der ektopische Genexpression in naiven T-Zellen nicht behindert werden. So sind zum Beispiel die Elektroporation und die retrovirale Transduktion nur wirksam in aktivierten T-Zellen. Im Gegensatz zu den ursprünglichen Erwartungen lentiviralen Transduktion, die in der Regel wirksam in ruhenden Zellen ist, erfordert vor Aktivierung naiver T-Zellen durch Zytokine 13. Ferner kann die Übertragung von cDNA oder mRNA bei der Elektroporationbeinhaltet Depolarisation der Zellmembran, die sich verleiht Eigenschaften der T-Zell-Aktivierung und sogar mobilisieren Ca 2 +-Signalisierung und aktivieren NFAT Proteinen (unveröffentlichte Beobachtung und ref. 14). Auch für retrovirale Transduktion haben die naiven T-Zellen für 18 aktiviert werden – 40 Stunden. Während dieser Zeit erfolgt die Auswertung der Kernmembran im Verlauf der Zellteilung ermöglicht und für die nachfolgende genomische Integration des retroviralen Vektors 15. Diese Methoden sind daher nicht in der Lage, um die frühe molekulare Regulation der ersten Begegnung mit T-Zell-Antigen, das die entscheidende Phase der Helfer-T-Zell-Differenzierung ist anzugehen.
Adenovirus-Transduktion ist bekannt, ektopische transienten Genexpression in einer Reihe von humanen Zelltypen, die den menschlichen Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor (CAR) zum Ausdruck zu verleihen. Es geht ohne Anforderung für Zell-Aktivierung oder Zellzyklus-Progression. Die Oberflächenexpression von CAR ist von wesentlicher Bedeutung für eine effiziente Bindung und Internalisierung Virus, und transgene Expression der verkürzten Version CARΔ1 unter einem T-Zell-spezifischen Promotors wurde festgestellt, dass Mäusethymozyten und T-Zellen anfällig für Adenovirusinfektion 16 machen. Wichtig ist, dass das Transgen nicht ändern Thymozyten Entwicklung oder in vitro Differenzierung von naiven CD4-T-Zellen in verschiedene Untergruppen (Daten nicht gezeigt; ref 17.). Adenovirus-vermittelte Transduktion von T-Zellen wurde zuvor zur Überexpression 17,18 verwendet und Knock-down-Ansätze 19,20. Die transgenen T-Zellen können aus kommerziell erhältlichen DO11.10 tg gereinigt werden; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. und 17 ref.). Wichtig ist, ermöglicht adenoviralen Transduktion hohe Expression eines Gens von Interesse in naive T-Zellen zu induzieren, ohne offensichtliche Anzeichen der Aktivierung. Die T-Zellen bleiben naive (CD44 niedrig, CD62L hoch) und Ruhe-(CD25 -, CD69 -) nach infectiauf und kann aktiviert und in Treg ähnlich nicht infizierten Zellen unterschieden werden.
Herstellung von rekombinanten Adenoviren nach Transfektion von Zellen mit adenoviralen HEK293A Plasmide (Abbildung 1) erreicht werden. Diese Plasmide enthalten in der Regel den menschlichen Adenovirus Typ 5-Genom mit E1 und E3 Gene gelöscht rekombinanten Adenoviren replikationsinkompetent 21 machen. HEK293A Zellen ergänzen Replikationsdefizienz, wie sie durch stabile Integration geschert Adenovirus 22 verewigt haben. Seit Adenovirusvektoren groß (~ 40 kb) und damit nicht gut für traditionelle Restriktionsenzym-vermittelte Klonierung geeignet sind, beschäftigten wir das Gateway-System. Das Gen von Interesse wird zunächst in einem kleineren Eingangsvektor, aus dem sie leicht in das adenovirale Zielvektor über Lambda Rekombination (LR) 23 übertragen werden können kloniert. Wir konstruierten die pCAGAdDu Vektordurch die Kombination der CAG-Promotor (Huhn Actin-Promotor und CMV-Enhancer) mit einer Expressionskassette, enthaltend LR flankieren die prokaryotische ccdB Selektionsmarker 24. Diese Expressionskassette ist mit einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES-Element), die Co-Expression der eukaryontischen Infektionsmarker enhanced green fluorescent protein (eGFP), die zu einer Sequenz, die die Rinder-Wachstumshormon-poly (A)-Signal fusioniert ist ermöglicht fusioniert. Wir haben die CAG cis-regulatorische Sequenzen, da die prototypischen CMV-Promotor wurde als hoch-Aktivierung ab und sind daher ungünstig für die Genexpression in naive T-Zellen.
Hier bieten wir ein Protokoll für die effiziente in vitro Treg Differenzierung und eine Methode, um naive CD4 T-Zellen ohne Aktivierung (Abbildung 2) transduzieren. Das Verfahren ermöglicht ektopische Genexpression oder niederzuschlagen vorhergehenden CD4 T-Zell-Differenzierung bei der naiven Zustand. Es ermöglicht die Prüfung der Wirkung einer overexpressed Gen von Interesse in der frühen Signalwege beim erstmaligen TCR Stimulation bis T-Zell-Untergruppe Engagement. Unsere Validierungsexperimente auch die Grundlage, um ähnliche Adenovirus Anwendung bei der Differenzierung von anderen T-Zell-Untergruppen wie Th1, Th2, Th9, Th17, Th22 oder Tfh Zellen zu etablieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Virus Generierung und Titration
Für eine optimale Transfektion Ergebnisse scheinen die Qualität und Menge der linearisierte Vektor wichtigste. Konnten wir nicht beobachten negative Auswirkungen auf die primären Lysat Produktion von einer anfänglichen Überwucherung der Kultur seit der Infektion schnell gehen wird, sobald effiziente Virus-Produktion auftritt. Virus kann jedoch die Produktion um HEK293A Zellen durch lange Einsätze, die die Effizienz verringern betroffen sein. Einige offene L…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Lirui Du für den Bau des pCAGAdDU Vektor und Oliver Gorka für die Bereitstellung der Fixierung Protokoll danken.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 |
| PacI | New England Biolabs | R057S |
| jetPEI | Polyplus-transfection | 101-10N |
| HEK293A Cell Line | Invitrogen | R705-07 |
| A549 | ATCC | CCL-185 |
| 6-well plates | BD Falcon | 353046 |
| 14 cm tissue culture dish | Nunc | 168381 |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Invitrogen | 15630-056 |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 |
| MEM Essential vitamin mixture (100x) | Lonza | 13-607C |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation | Invitrogen | 114-56D |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
Riferimenti
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H. Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen. Nature Immunology. 6 (12), 1219-1227 (2005).
- Zhang, X., Izikson, L., Liu, L., Weiner, H. L. Activation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells by oral antigen administration. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 167 (8), 4245-4253 (2001).
- Josefowicz, S. Z., Niec, R. E., et al. Extrathymically generated regulatory T cells control mucosal TH2 inflammation. Nature. 482 (7385), 395-399 (2012).
- Samstein, R. M., Josefowicz, S. Z., Arvey, A., Treuting, P. M., Rudensky, A. Y. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150 (1), 29-38 (2012).
- Laurence, A., Amarnath, S., et al. STAT3 Transcription Factor Promotes Instability of nTreg Cells and Limits Generation of iTreg Cells during Acute Murine Graft-versus-Host Disease. Immunity. 37 (2), 209-222 (2012).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. Immunoregulatory T cells in tumor immunity. Current Opinion in Immunology. 16 (2), 157-162 (2004).
- Li, X., Kostareli, E., Suffner, J., Garbi, N., Hämmerling, G. J. Efficient Treg depletion induces T-cell infiltration and rejection of large tumors. European Journal of Immunology. 40 (12), 3325-3335 (2010).
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Chen, W., Jin, W., et al. Conversion of Peripheral CD4+CD25- Naive T Cells to CD4+CD25+ Regulatory T Cells by TGF-β Induction of Transcription Factor Foxp3. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1875-1886 (2003).
- Xu, W., Lan, Q., et al. Adoptive transfer of induced-treg cells effectively attenuates murine airway allergic inflammation. PloS ONE. 7 (7), e40314 (2012).
- Circosta, P., Granziero, L., et al. T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR. Human Gene Therapy. 20 (12), 1576-1588 (2009).
- Patel, C., Muthuswamy, J. High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA). J. Vis. Exp. (67), e4415 (2012).
- Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J. Vis. Exp. (44), e2307 (2010).
- Leon, R. P., Hedlund, T., et al. Adenoviral-mediated gene transfer in lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (22), 13159-13164 (1998).
- Wan, Y. Y., Leon, R. P., et al. Transgenic expression of the coxsackie/adenovirus receptor enables adenoviral-mediated gene delivery in naive T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13784-13789 (2000).
- Hurez, V., Dzialo-Hatton, R., Oliver, J., Matthews, R. J., Weaver, C. T. Efficient adenovirus-mediated gene transfer into primary T cells and thymocytes in a new coxsackie/adenovirus receptor transgenic model. BMC Immunology. 3, 4 (2002).
- Eitelhuber, A. C., Warth, S., et al. Dephosphorylation of Carma1 by PP2A negatively regulates T-cell activation. The EMBO Journal. 30 (3), 594-605 (2011).
- Glasmacher, E., Hoefig, K. P., et al. Roquin binds inducible costimulator mRNA and effectors of mRNA decay to induce microRNA-independent post-transcriptional repression. Nature Immunology. 11 (8), 725-733 (2010).
- Russell, W. C. Update on adenovirus and its vectors. The Journal of General Virology. 81 (Pt. 11), 2573-2604 (2000).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annual Review of Biochemistry. 58, 913-949 (1989).
- Bernard, P., Couturier, M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of DNA-topoisomerase II complexes. Journal of Molecular Biology. 226 (3), 735-745 (1992).
- Thai, T. -. H., Calado, D. P., et al. Regulation of the Germinal Center Response by MicroRNA-155. Science. 316 (5824), 604-608 (2007).
- Rodriguez, A., Vigorito, E., et al. Requirement of bic/microRNA-155 for Normal Immune Function. Science. 316 (5824), 608-611 (2007).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. The Journal of Experimental Medicine. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Steiner, D. F., Thomas, M. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. , (2011).
