Isolering av embryonala Ventrikulära Endotelceller
Summary
Primär cellkultur är en användbar teknik för att analysera specifika populationer av celler, särskilt från transgena musembryon vid specifika utvecklingsstadier. Häri är embryonala ventriklar dissekeras och dissocierade, och antikroppar konjugerade pärlor igen och skilja ut de endotelceller för vidare analys.
Abstract
Cellkultur har förbättrats avsevärt vår förmåga att bedöma enskilda populationer av celler under otaliga odlingsbetingelser. Medan odödliga cellinjer erbjuder betydande fördelar för sin användarvänlighet, dessa cellinjer är tillgängliga för alla potentiella celltyper. Genom att isolera primära celler från en viss region av intresse, särskilt från en transgen mus, kan mer nyanserade studier göras. Den grundläggande tekniken innebär att dissekera organ eller partiell organ av intresse (t.ex. hjärta eller en specifik region av hjärtat) och dissociation orgeln till enstaka celler. Dessa celler inkuberas sedan med magnetiska kulor konjugerade till en antikropp som känner igen celltypen av intresse. Cellerna av intresse kan sedan isoleras med användning av en magnet, med en kort trypsin inkubation dissociera cellerna från pärlorna. Dessa isolerade cellerna kan sedan odlas och analyseras som önskas. Denna teknik var ursprungligen avsedd för en vuxen mus orgels men kan enkelt skalas ner för användning med embryonala organ, såsom visas häri. Eftersom vårt intresse ligger i att utveckla kranskärlen, ville vi studera denna population av celler under specifika embryonala stadier. Således hade det ursprungliga protokollet ändras för att vara förenlig med den lilla storleken av de embryonala ventriklar och den låga potentiella avkastningen av endotelceller vid dessa utvecklingsstadier. Utnyttja denna förminskad synsätt, har vi bedömt koronar plexus ombyggnad i transgena embryonala ventricular endotelceller.
Introduction
Tillkomsten av odödliga cellinjer har revolutionerat grundläggande cellbiologi 1. De för närvarande tillgängliga cellinjer är härledda från en rad olika organ och omfattar alla de stora celltyper. Men etablerade cellinjer har vissa begränsningar. Processen för immortalisering förändras givetvis beteendet hos de celler, specifikt med avseende på livslängd och proliferation, men kan också påverka uttrycket av oväntade proteiner, såsom cytoskelettproteiner 2. Dessutom, även om många olika cellinjer finns tillgängliga, det finns en betydande mångfald bland ens en enda celltyp inom en hel organism. Endotelceller i särskilt visa olika beteenden baserat på om de rada artärer eller vener och vilken typ av flöde finns i kärlet 3. Ännu mer pressning ur ett utvecklingsperspektiv är emellertid att de allra flesta av de tillgängliga cellinjer är härledda från vuxen vävnad (se t.ex. tHan samlingen tillgänglig via ATCC). Dessa vuxna cellinjer sannolikt inte rekapitulera inte den dynamiska karaktären hos deras embryonala prekursorer. De snabbt växlande Spatiotemporal genuttryck mönster som framträtt under utvecklingen tyder också på att en endotelcell från ett organ vid en given utvecklingsstadium kanske inte beter sig på samma sätt som en endotelcell från samma organ på en annan utvecklingsstadiet.
Som ett alternativ till användning av kommersiellt tillgängliga odödliggjorda cellinjer, kan primära celler isoleras från den specifika vävnaden av intresse. Bland fördelarna med denna teknik, kan dessa primära celler isoleras från ett specifikt organ eller en del av ett organ vid vilken specifik utvecklingsstadiet. Vidare kan dessa primära celler isoleras från det stora utbudet av tillgängliga transgena djur, vilket gör att in vitro-studie av genknockout och knock-in samtidigt som man undviker andra problem såsom transfektionseffektivitet. Inte överraskande, mångatekniker har publicerats beskriver hur man isolera specifika celltyper 4,5. I allmänhet innebär dessa tekniker samla regionen av intresse, dissociera cellerna, tagga den specifika celltyp av intresse, och isolera dessa celler för vidare analys.
För att studera en tidig embryonal population av koronära endotelceller, skalas vi ner en tidigare publicerad teknik 4 för användning tillsammans med ett mindre organ. Med denna förminskad förfarande, kan vi isolera de koronara endotelceller från embryonala hjärtat vid specifika embryonala stadier. Dessa celler kan sedan användas i traditionella endothelial analyser, såsom migration analyser. Tills tidiga embryonala cellinjer blivit vanligare, som arbetar med de primära celler är en ovärderlig teknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Arbeta med primära embryonala celler gör nya försök att lösa in vitro kritiska steg i utvecklingen. Dock är isoleringsförfarandet inte trivialt. Kritiska steg för att isolera någon typ av celler inkluderar att säkerställa att cellerna är väl separerade vid kollagenasdigerering och sedan att de är väl suspenderade under tvätten steg. Mekanisk dissektion genom pipettering hjälper mycket separera cellerna under kollagenas steget, och filtreringssteget avlägsnar klumpar av celler. Dessa steg förb…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Andrea Portbury för kritisk läsning av manuskriptet, mikroskopet service Laboratoriet för UNC för hjälp med time-lapse avbildning, och NIH (bidrag # R01HL061656) för finansieringsstöd.
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercaptoethanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 |
Riferimenti
- Landecker, H. . Culturing Life: How Cells Became Technologies. , (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
