Titration biochimique de glycogène<em> In vitro</em
Summary
Nous décrivons ici une méthode biochimique précis, reproductible et pratique pour le titrage de glycogène in vitro. Cette technique utilise la trousse de dosage Abcam glycogène et est basé sur l'hydrolyse successive du glycogène en glucose et glucose titrage par fluorescence.
Abstract
Le glycogène est le principal polymère énergétique de glucose chez les animaux vertébrés et joue un rôle essentiel dans le métabolisme du corps tout entier, ainsi que dans le métabolisme cellulaire. Beaucoup de méthodes de détection glycogène existent déjà, mais seulement quelques-uns sont d'ordre quantitatif. Nous décrivons ici un procédé utilisant la trousse de dosage Abcam glycogène, qui est basé sur la dégradation spécifique du glycogène en glucose par la glucoamylase. Le glucose est ensuite oxydé spécifiquement à un produit qui réagit avec la sonde OxiRed pour produire la fluorescence. Le titrage est précise, sensible et peut être réalisé sur des extraits cellulaires ou des coupes de tissus. Cependant, contrairement à d'autres techniques, elle ne donne pas d'informations sur la distribution de glycogène dans la cellule. Comme exemple de cette technique, nous décrivons ici le titrage de glycogène dans les deux lignées cellulaires, les Chinois CCL39 de fibroblastes de poumon de hamster et LS174 de carcinome du côlon humain, incubées en normoxie (21% O 2) par rapport à l'hypoxie (1% d'O 2). Nous émettons l'hypothèse que l'hypoxie est un signalnal qui prépare les cellules à synthétiser et stocker du glycogène pour survivre 1.
Introduction
Le glycogène est un polymère multibranche de résidus de glucose, qui est présent dans le cytoplasme de nombreux types de cellules. Elle est l'une des principales formes de stockage d'énergie dans les cellules et joue un rôle important dans le métabolisme du glucose. La plupart des cellules de mammifères sont capables de produire et stocker du glycogène, qui peut être rapidement dégradé en glucose pour promouvoir la glycolyse et de l'ATP production au cours du stress métabolique. Les hépatocytes produisent des quantités massives de glycogène pour réguler le niveau de sucre sanguin fournissant ainsi une alimentation continue en glucose dans le corps. En revanche, la concentration de glycogène dans les autres cellules (muscles, les globules rouges, etc) est relativement faible. Cependant, localement, ces quantités sont suffisantes pour fournir de l'énergie à court terme quand les cellules sont soudainement exposés à un environnement privé de nutriments.
la synthèse de glycogène et la dégradation du glycogène suit les mêmes étapes dans tous les tissus (Figure 1). Tout d'abord, le glucosepénètre dans les cellules par des transporteurs du glucose (GLUT), et est rapidement transformé à partir de glucose-6-phosphate (G6P) en glucose-1-phosphate (G1P) par phosphoglucomutase. G1P est alors modifiée en UDP-glucose et le carbone C1 de l'UDP-glucose est attaché à un résidu de tyrosine de glycogénine, la protéine d'ancrage de glycogène. Cette molécule, considérée comme une amorce de glycogène, est prolongée par la fixation de l'UDP-glucose au glucose terminal par un α (1 → 4) liaison via la glycogène synthase. Enfin, quand une chaîne linéaire de plus de 11 résidus de glucose est formée, l'enzyme de branchement transmet une borne oligosaccharide constitué par un minimum de six résidus glucose glucose à l'autre de la chaîne à proximité par le biais d'une α (1 → 6) de liaison. La répétition de ce processus donne une structure massive fractale contenant branches qui forment une hélice avec 6,5 glucose par tour. Le glycogène peut être inverse hydrolysé en glucose par l'action concertéede déramification enzymes qui hydrolysent l'α (1 → 6) et lié glycogène phosphorylase qui hydrolyse l'α (1 → 4) lié glycosidique entre le dernier résidu de glucose et une branche de la molécule de glycogène. Cette réaction appelé glycogénolyse est activée en augmentant les niveaux d'AMP (reflétant la consommation d'ATP), et inhibée par le glucose et l'ATP 2,3.
Par microscopie électronique, les molécules de glycogène ont été décrits dans de nombreux types cellulaires que les particules libres (ou β monoparticules de glycogène) de 15 à 30 nm de diamètre. Dans des types cellulaires spécifiques, telles que les hépatocytes, les particules β peuvent être assemblés en un ensemble pour former des rosettes, également connus en tant que particules α qui varient en diamètre de 80 nm à un maximum de 200 nm 4 </sup>. La manière dont ces particules β sont liés pour former de plus grands agglomérats de particules α n'est pas encore totalement élucidé. Certaines preuves tend à prouver que les particules β peuvent être liés par liaison covalente 5, une liaison hydrogène, ou encore au moyen d'interactions protéine-protéine 6. La quantité de glycogène dans les cellules dépend de nombreux paramètres: (I) la quantité de glycogénine dans la cellule qui initie la synthèse du glycogène, (II) l'activité de la glycogène synthase et phosphorylase régulée par la phosphorylation des protéines / déphosphorylation, (III) la concentration du glucose dans les cellules, ce qui est dépendante de plusieurs paramètres, tels que la fourniture de glucose à partir du système vasculaire et de la captation du glucose par les cellules. les réserves de glycogène sont strictement réglementées par régulation allostérique d'hormones biosynthétiques par les métabolites intermédiaires, par des hormones de régulation du métabolisme énergétique, et par des éléments nutritifs de détection de signalisation des voies 7.
Il est important d'êtremesure de quantifier le glycogène dans des échantillons biologiques afin de mieux comprendre l'importance du métabolisme du glycogène dans le corps entier et au niveau cellulaire. Nous décrivons ici un biochimique précis, reproductible et pratique dans le test in vitro pour le glycogène. Cette technique est basée sur la quantification de la fluorescence du glucose avant et après l'hydrolyse spécifique de glycogène.
D'autres méthodes existent pour estimer le niveau de glycogène dans les cellules, mais la plupart d'entre eux ne sont pas quantitatifs. Une des premières techniques décrites pour la quantification de glycogène dans les cellules était basée sur la mesure de la [14C]-glucose en glycogène 8,9 incorporation. L'utilisation de la radioactivité qui rend ce procédé plus difficile à manipuler mais elle a l'avantage d'offrir le taux d'incorporation du glucose dans le glycogène et à faire la distinction entre la distribution des résidus de glucose sur les branches extérieures et dans le noyau de la molécule (elle nécessite également un supplémentaire β-amylolysis et une étape de chromatographie). Une autre technique a été développée plus récemment et est basé sur l'incorporation de 2-NBDG (2 – {N-[7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3-diazole-4-yl] amino}-2-désoxyglucose), un 2-désoxyglucose dérivé fluorescent, en glycogène 10. L'intensité de fluorescence mesurée reflète la quantité de glycogène produit et peut être mesurée avec un lecteur de fluorescence. La distribution de la fluorescence de la cellule peut aussi être évaluée par microscopie confocale.
Parmi les autres techniques non quantitatives, l'acide périodique de Schiff coloration (PAS) est peut-être le plus commun. Il peut être utilisé pour la détection de glycogène dans les cellules fixées, les coupes de tissu dans de la paraffine ou de gelée. Cette histologiques couleurs de technique non spécifiquement polysaccharides, des glycolipides, des glycoprotéines, la cellulose et les mucines neutres en violet. La spécificité de ce test peut être augmentée par le traitement des cellules fixes ou des sections de tissu avec diastase, qui digère spécifiquement le glycogène. Par la suite,le niveau de glycogène peut être estimée qualitativement en comparant des échantillons non hydrolysées (tous les hydrates de carbone modifié de macromolécules) à des échantillons hydrolysées (glucides macromolécules modifié, sauf glycogène). La coloration et l'analyse microscopique, à la différence des essais biochimiques de glycogène, fournit des informations concernant la distribution de glycogène dans la cellule, qui peut être diffusé ou concentré dans une certaine partie de la cellule. Cependant, même si les estimations de coloration PAS des différences dans l'accumulation de glycogène entre des conditions différentes, il n'est pas quantitative 11.
Un anticorps monoclonal de souris à l'origine faite en utilisant cartilage condylien mandibulaire a été montré que l'antigène de réagir avec du glycogène dans les cellules et à la glycogène purifiée in vitro 12. Comme cet anticorps reconnaît spécifiquement des chaînes de sucres liées glycogène, il est un outil utile pour la détection de glycogène par immunohistochimie d'une manière plus précise que la coloration PAS. </p>
La microscopie électronique est une autre technique qui permet la visualisation des grains de glycogène dans les cellules et l'évaluation du degré de stockage du glycogène. En fait, les particules β de glycogène sont facilement reconnaissables avec un microscope électronique en électrons granules denses 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Titrage biochimique de glycogène in vitro permet une quantification précise des cellules contenu glycogène. Comparé à d'autres techniques (PAS, immunofluorescence avec un anticorps de glycogène, etc.), Ce titrage est très spécifique, sensible et reproductible. En outre, le procédé est commode car il ne nécessite pas de radioactivité, mais un spectromètre à fluorescence. Cependant, cette technique est purement quantitative et ne fournit pas d'informations sur la distribution de gly…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants au Dr Thierry Pourcher pour nous permettre d'utiliser le spectromètre de fluorescence et pour son aide. Le laboratoire est financé par la Nationale Contre le Cancer le Ligue (Equipe de labellisée), l'Association pour la Recherche contre le cancer, l'Institut National du Cancer (INCa), l'Agence Nationale pour la Recherche, METOXIA (programme FP7), le Centre A. Lacassagne, le Centre National de la Recherche Scientifique, l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale et l'Université de Nice ( http://www.unice.fr/isdbc/ ). Nous remercions le Dr Christiane M Brahimi-Horn pour la lecture critique et correction rédactionnelle.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen | 31966.047 | |
| Glycogen Assay Kit | Abcam | ab65620 | |
| PBS | |||
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Fluorescence Spectrometer | PerkinElmer | LS 50B |
Riferimenti
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