एंटीबायोटिक प्रतिरोधी Staphylococcus बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए biosensor
Summary
Lytic फेज biosensors और एंटीबॉडी मोती Methicillin प्रतिरोधी (मरसा) और संवेदनशील Staphylococcus बैक्टीरिया के बीच भेदभाव करने में सक्षम हैं. फगेस एक क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance सेंसर की एक सतह पर एक Langmuir-Blodgett विधि द्वारा स्थिर और व्यापक रेंज staphylococcus जांच के रूप में काम कर रहे थे. एंटीबॉडी मोती मरसा पहचाना.
Abstract
स्ताफ्य्लोकोच्चुस उपभेदों की एक व्यापक मेजबान रेंज और एक पेनिसिलिन बाध्यकारी प्रोटीन (PBP 2 ए) प्रतिरक्षी संयुग्मित लेटेक्स मोती Methicillin प्रतिरोधी (मरसा) और संवेदनशील (MSSA) एस के भेदभाव के लिए बनाया गया एक biosensor बनाने के लिए उपयोग किया गया है होने के एक संरचनात्मक रूप से बदल अपघट्य जीवाणुभोजी . ऑरियस प्रजातियों 1,2. अपघट्य फगेस पानी के क्लोरोफॉर्म इंटरफेस के साथ संपर्क से फेज spheroids में तब्दील कर दिया गया है. फेज अंडाकार आकृति monolayers Langmuir-Blodgett (पौंड) तकनीक 3 से एक biosensor सतह पर ले जाया गया है. बनाया biosensors के बैक्टीरिया फेज बातचीत का मूल्यांकन अपव्यय ट्रैकिंग के साथ एक क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance (QCM डी) द्वारा जांच की गई है. बैक्टीरिया अंडाकार आकृति बातचीत कम अनुनाद आवृत्ति और MRSA और MSSA उपभेदों दोनों के लिए अपव्यय ऊर्जा में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व किया. बैक्टीरियल बंधन के बाद, इन सेंसरों आगे पेनिसिलिन बाध्यकारी प्रोटीन एंटीबॉडी लेटेक्स मनका को उजागर किया गया हैएस. मरसा के साथ विश्लेषण सेंसर 2a एंटीबॉडी मोती PBP को जवाब दिया, MSSA साथ निरीक्षण सेंसर कोई जवाब नहीं दिया है. इस प्रयोगात्मक भेद Methicillin प्रतिरोधी और संवेदनशील एस के बीच एक स्पष्ट भेदभाव को निर्धारित करता है aureus उपभेदों. समान रूप से बाध्य है और अपार bacteriophages सतहों पर और पानी निलंबन में बैक्टीरिया विकास को दबाने. अपघट्य फगेस spheroids में बदल रहे हैं, वे अपने मजबूत अपघट्य गतिविधि को बनाए रखने और उच्च बैक्टीरियल कब्जा क्षमता दिखा. फेज और फेज spheroids एंटीबायोटिक प्रतिरोधी सूक्ष्मजीवों का परीक्षण और नसबंदी के लिए उपयोग किया जा सकता है. अन्य अनुप्रयोगों जीवाणुभोजी चिकित्सा और रोगाणुरोधी सतहों में शामिल हो सकते हैं.
Introduction
स्ताफ्य्लोकोच्चुस की Methicillin प्रतिरोधी उपभेदों आवश्यक संक्रमण और nosocomial प्रकोप 4-8 में एक कारक के रूप में सुझाव दिया गया है. ऐसी डिस्क प्रसार oxacillin अगर स्क्रीन टेस्ट, या शोरबा microdilution रूप मेथिसिलिन प्रतिरोध की मान्यता के आम तरीकों,, प्रतिरोध की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए सिलवाया संस्कृति की स्थिति पर निर्भर हैं. बदलाव oxacillin का उपयोग, डिग्री सेल्सियस की बजाय 37 डिग्री सेल्सियस से 30 या 35 पर ऊष्मायन, और मध्यम विकास के लिए NaCl के शामिल किए जाने हैं. इसके अलावा, तकनीक के इन प्रकार से सही पता लगाने के लिए, 24 घंटे की लंबी ऊष्मायन अवधि के बजाय 16 से 18 घंटे की आवश्यकता है. मेथिसिलिन प्रतिरोध की पहचान के लिए संवेदनशीलता के उपयुक्त (> 96%) स्तर के साथ तेजी से तकनीक 3-11 घंटे के बाद परिणाम का उत्पादन है, जो इस तरह के Vitek जीपीएस एसए कार्ड, रैपिड ATB Staph प्रणाली, और रैपिड Microscan पैनल सिस्टम के रूप में स्वचालित microdilution तकनीकों में शामिल 9-11. क्रिस्टल एमआरएसए आईडी सिस्टम एस के विकास की मान्यता पर आधारित एक तेजी से विधि है 2% NaCl और एक ऑक्सीजन के प्रति संवेदनशील प्रतिदीप्ति संवेदक के साथ प्रति लीटर oxacillin की 4 मिलीग्राम की उपस्थिति में ऑरियस. दावा संवेदनशीलता ऊष्मायन 12-14 के 4 घंटे के बाद 100-91% के बीच सीमा होती है. ये प्ररूपी तरीकों विषम प्रतिरोध व्यक्त कि प्रचलित उपभेदों के प्रभाव से उनके accuracies में सीमित कर रहे हैं. इसलिए, मेथिसिलिन प्रतिरोध की मान्यता के लिए सबसे अच्छा व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं तरीकों Meca जीन 15 से पीसीआर या डीएनए संकरण है. हालांकि इस तकनीक का शुद्ध डीएनए की आवश्यकता है और सेल मलबे 16 में शामिल हैं जो विभिन्न admixtures (दोष), के प्रति बेहद संवेदनशील है.
इसके अलावा, इन तकनीकों का प्रदर्शन करने के लिए एक लंबे समय की जरूरत है. Meca जीन उत्पाद, प्रोटीन PBP 2 ए, की पहचान करने के लिए रणनीति प्रतिरोध का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है और मानक परीक्षण तकनीक 17 की तुलना में अधिक विश्वसनीय हो सकता है.
<p clasएस = "jove_content"> यह पहले जीवाणुभोजी 12600 मेथिसिलिन प्रतिरोध 1,2,18 होने के उन सहित स्ताफ्य्लोकोच्चुस उपभेदों के लिए एक मान्यता जांच के रूप में उपयोग किया जा सकता है कि दिखाया गया था. इस काम में हम इस तरह के वास्तविक समय में MRSA की रचना के साथ बैक्टीरिया की पहचान के रूप में MRSA के विशिष्ट पहचान और पता लगाने में एक उपन्यास तकनीक का प्रस्ताव रखा. इस विशेष उद्देश्य के एक एस के लिए प्रोटीन के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ संयुक्त सेनाओं के एक व्यापक स्पेक्ट्रम (MRSA उपभेदों सहित) के साथ ऑरियस जीवाणुभोजी (PBP 2 ए) का इस्तेमाल किया गया है. PBP 2a एक कोशिका दीवार प्रोटीन होता है और यह MRSA के एंटीबायोटिक प्रतिरोधकता के कारण है. हालांकि PBP 2a एंटीबॉडी एस के लिए विशिष्ट नहीं है कुछ अन्य बैक्टीरिया के बाद ऑरियस PBP 2a 19,20 को अनुक्रम समानता के साथ एंटीबायोटिक बंधनकारी प्रोटीन है. नतीजतन इस काम में, एस PBP 2a प्रोटीन के खिलाफ ऑरियस जीवाणुभोजी और एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया है. Specifi के लिए एक biosensor विकसित करने में सक्षम होना करने के लिएबड़ी सफाई एक दो कदम कार्रवाई उपयोग किया गया है के साथ एक डिवाइस का पता लगाने और मरसा पहचान. प्रारंभिक कदम के लिए एक एस इस्तेमाल किया एक संवेदक जांच के रूप में ऑरियस जीवाणुभोजी monolayer, दूसरे चरण PBP 2a विशिष्ट एंटीबॉडी कार्यरत है. इसलिए, एक एस पहचाना जाएगा कदम aureus जीवाणु, एक दूसरे के रूप में एंटीबायोटिक बाध्यकारी प्रोटीन के प्रति संवेदनशील होना होगा. दो कदम से प्राप्त संकेतों को सकारात्मक रहे हैं, यह मरसा की विशिष्ट पहचान को दर्शाता है.Protocol
Representative Results
Discussion
यह अच्छी तरह से फगेस बैक्टीरियल रोगज़नक़ों 28 के लिए biosensor जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि जाना जाता है. तेजी से भेदभाव एंटीबायोटिक प्रतिरोधी और संवेदनशील उपभेदों: यह PBP 2a एंटीबॉडी के साथ एक ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस के साथ साथ काम की रिपोर्ट कपिश विश्वविद्यालय AUDFS और यूएसएएफ CRADA 07-277-60MDG -01 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. इस लेख में व्यक्त विचार लेखक के हैं, और सरकारी नीति या संयुक्त राज्य वायु सेना, रक्षा विभाग, या अमेरिकी सरकार की स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं करते.
Materials
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| spectrophotometric-grade chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 154733 | (99.8% A.C.S.) |
| Hexane-Anhydrous | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 29609-0 | (95%) |
| Ethyl Alcohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT | 64-17-5 | 190 Proof |
| Equipment | |||
| PBP 2a antibody conjugated latex beads | Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan | The MRSA-Screen test | |
| S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from | American Type Culture Collection (Manassas, VA); | ||
| MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 | The culture collection of Auburn University, Auburn, AL | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K Ultra Centrifuge | |
| KSV 2200 LB film balance | KSV Chemicals, Finland | ||
| Light microscope optical system | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| QCM-D | Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden | E4 | |
| Scanning electron microscope (SEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL-7000F SEM | |
| Transmitting electron microscopy (TEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL, JEM 2010 | |
| Stericup, Presterilized | Millipore Corporation, Billerica, MA | SCGPU05RE | 0.22 μm, GP Express PLUS membrane |
| Bio-Assay dish | NUNC A/S, Denmark | 240835 | Dimensions(mm), 245 x 245 x 25 |
| Pipettes | Gilson, Pipetman, France | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific, CT | Classic C24 | |
| Gold-coated quartz pieces | Auburn University, AL | Homemade | |
| Petri dishes | Fisher Brand, USA | 0875713 | 100 mmX15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, ME | SG403 | |
| Culture Growing Flasks | Corning Incorporated, NY | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks |
| Optical Spectrometer | Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. | 4001 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma, USA | PDC-32G | |
| Millipore water purification system | Millipore | Direct-Q | |
| Imaging Ellipsometer | Accurion, USA | nanofilm_ep3se | |
| Software | Q-Sense AB, Sweden | QSoft, QTools |
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